實(shí)驗(yàn)四逆轉(zhuǎn)錄PCRRTPCRWord版

1、傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！實(shí)驗(yàn)四 逆轉(zhuǎn)錄pcr (rt-pcr)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解用逆轉(zhuǎn)錄pcr法獲取目的基因的原理。2學(xué)習(xí)和掌握逆轉(zhuǎn)錄pcr的技術(shù)和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增dna序列。因?yàn)樯弦惠喌臄U(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，使其成為檢測(cè)核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板dna擴(kuò)增達(dá)106 倍。rt-pcr將以rna為模板的cdna（complement dna）合成（即rna的反轉(zhuǎn)錄（rt，reversetranscription），同

2、cdna的pcr結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基因表達(dá)檢測(cè)、定量和cdna克隆的快速靈敏的方法。由于cdna包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子，只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達(dá)和功能研究，因此rt-pcr成為目前獲得目的基因的一種重要手段。 rt-pcr技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、表達(dá)差異，細(xì)胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。rt-pcr比其他包括northern印跡、rnase保護(hù)分析、原位雜交及s1核酸酶分析在內(nèi)的rna分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。 rt-pcr的基本原理（圖4.1）。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從rna合成 cdna，即總r

3、na中的mrna在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成dna拷貝，因拷貝dna的核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mrna，稱之為互補(bǔ)dna（cdna）；然后再利用dna聚合酶，以cdna第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dntp）為材料，在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cdna或目的片段。 在rt時(shí)，有3種引物可選擇 （表4.1) 。用1）和2）方法，理論上是擴(kuò)增的所有的cdna，還要用此產(chǎn)物做pcr的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等軟件設(shè)計(jì)引物。rt-pcr可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。兩步法rt-pcr比較常見，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)或克隆

4、多個(gè)基因的mrna時(shí)比較有用。在兩步法rt-pcr中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cdna的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行pcr。而一步法rt-pcr具有其它優(yōu)點(diǎn)（表4.2），cdna合成和擴(kuò)增反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，最低可以達(dá)到0.1pg總rna，因?yàn)檎麄€(gè)cdna樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法rt-pcr，一般使用基因特異性引物(gsp)起始cdna的合成。由圖4.1不難看出，隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長(zhǎng)度的cdna。這種方法經(jīng)常用于獲取5末端序列及從

5、帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的rna模板獲得cdna。為了獲得最長(zhǎng)的cdna，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)rna樣品中引物與rna的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20l反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總rna合成的cdna主要是核糖體rna，所以模板一般選用poly(a)+rna。 oligo(dt)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mrna 3端所發(fā)現(xiàn)的poly(a)尾雜交。因?yàn)閜oly(a)+rna大概占總rna的1%到2，所以與使用隨機(jī)引物相比，cdna的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dt)一般不需要對(duì)rna和引物的比例及poly(

6、a)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20l反應(yīng)體系使用0.5g oligo(dt)。oligo(dt)12-18適用于多數(shù)rt-pcr。 基因特異性引物（gsp）對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。gsp是反義寡聚核苷，可以特異性地同rna目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo(dt)那樣同所有rna退火。用于設(shè)計(jì)pcr引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)gsp的設(shè)計(jì)。gsp可以同與mrna 3最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或gsp可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！ 已經(jīng)制備好的雙鏈cdna和一般dna一樣，可以插入到質(zhì)粒或噬菌體中，為此，首先必需有適當(dāng)

7、的接頭(linker)，接頭可以是在pcr引物上增加限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)片段，經(jīng)pcr擴(kuò)增后再克隆入相應(yīng)的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cdna的末端接上一段寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。 本實(shí)驗(yàn)是要從小鼠肝臟組織中獲取fas配體基因，fas配體(fasl)是一分子量約為40u的ii型跨膜糖蛋白，屬tnf家族成員。活化的t細(xì)胞可表達(dá)fas和fasl，并通過fas/fasl系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在部分癌細(xì)胞中fasl表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們采用rt-pcr方法克隆fasl全長(zhǎng)cdna并構(gòu)建

8、其表達(dá)載體，可以為進(jìn)一步研究fasl的功能提供條件。在上下游引物的5端分別加上了限制酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基（即hind iii和bamh i），以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達(dá)載體pgfpuv上（附錄圖4.3）。 為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以用金屬螯和層析的方法分離和純化目的蛋白，我們改造了pgfpuv，在其上加了6his標(biāo)簽。傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！【試劑與器材】（一）試劑1.總rna（或mrna）2.rna酶抑制蛋白（rnase inhibitor） ：40 u/ml3.dntp 混合物 (各10 mm)4.oligo(dt)12-18：2.5 mmol

9、/l5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液（10rt buffer）：250 mmol/l tris-hcl (ph8.3)，375 mmol/l kcl，15 mmol/l mgcl26.amv逆轉(zhuǎn)錄酶 5u/ml7.基因特異性5和3引物各20 mmol/l 8.tap dna聚合酶 5u/ml9.10*pcr緩沖液：500mmol/l kcl，100mmol/l triscl，在25下，ph9.0，1.0% triton x-100，15mmol/l mgcl2。（二）器材1）pcr儀，2）pcr管，3）微量移液器【操作方法】（一）逆轉(zhuǎn)錄：1)建立rt反應(yīng)體系：傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助

10、，可雙擊去除！2)渦旋混勻，42反應(yīng)1小時(shí)，95加熱5分鐘，然后置于冰上。（二）pcr擴(kuò)增：1)建立pcr反應(yīng)體系：2)將上述反應(yīng)體系渦旋混勻, 按下列程序運(yùn)行循環(huán)： step2-4運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，其中復(fù)性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同。（三）取10-20ul pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，余下的pcr產(chǎn)物-20保存?！咀⒁馐马?xiàng)與提示】1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無rnaase環(huán)境，以避免rna的降解。2.成功的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)決定于高質(zhì)量的模板rna。高質(zhì)量的rna至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如edta或sds。此外，rt-pcr所遇到的一個(gè)潛在的困難是rna中沾染的基因組dna。使用

11、較好的rna分離方法，如trizol reagent，會(huì)減少rna制備物中沾染的基因組dna。因此在進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)應(yīng)該對(duì)每個(gè)rna模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)，以確定擴(kuò)增出來的片段是來自基因組dna還是cdna。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的pcr產(chǎn)物來源于基因組。3.rt-pcr的起始模板可是總rna或mrna，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果（如下圖）。另外，分離mrna會(huì)導(dǎo)致樣品間mrna豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有基因時(shí)，使用mrna會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！4.在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入rna酶抑制蛋白以增加cdna合成的

12、長(zhǎng)度和產(chǎn)量。rna酶抑制蛋白要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如dtt）存在的條件下加入，因?yàn)閏dna合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解rna的rnase。rna酶抑制蛋白僅防止rnase a，b，c對(duì)rna的降解，并不能防止皮膚上的rnase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗(yàn)者的手上rnase對(duì)樣品的污染。5.較高的保溫溫度有助于rna二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)rna模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將rna和引物在65保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對(duì)這些

13、困難模板的擴(kuò)增可以使用經(jīng)過改良的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶， 如：invitrogen 公司的thermoscript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。而且適當(dāng)提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加rt-pcr的特異性。6.建立反應(yīng)體系時(shí)，加完其它反應(yīng)物后，才加模板dna和taq dna聚合酶；然后將全部反應(yīng)物渦旋混勻；上pcr儀前加礦物油封蓋或設(shè)熱蓋。7.pcr反應(yīng)的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成非特異性擴(kuò)增和時(shí)間的浪費(fèi)。復(fù)性溫度的計(jì)算，一般是在引物的tm值上下浮動(dòng)，tm =2（a+t）+4（g+c）。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可提高pcr擴(kuò)增的特異性。8.不管是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)還是pcr反應(yīng)

14、都應(yīng)先調(diào)制試劑的master mix (包括rnase free dh2o、緩沖液、dntp mixture等)，然后分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑的體積更準(zhǔn)確，減少試劑的損失，避免重復(fù)分取同一試劑，同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作造成的誤差。而且分裝試劑時(shí)務(wù)必用新tip，以防止樣品間的污染。 9.amv、rnase inhibitor、taq等酶類，要輕輕地混勻，避免起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應(yīng)管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務(wù)必在實(shí)驗(yàn)前從-20取出，使用后立即放回-20保存。 10.最佳的pcr條件，因pcr擴(kuò)增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先做control反應(yīng)，以確定最佳的pcr條件。為延長(zhǎng)pcr儀的使用壽命，應(yīng)盡可能縮短pcr儀4保存的時(shí)間，盡量避免4過夜的情況。傳播優(yōu)秀word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！lane 1：總rna 的 rt-pcr 產(chǎn)物（人細(xì)胞調(diào)亡因子tf15基因） lane 2： mrna 的 rt-pcr 產(chǎn)物，人細(xì)胞調(diào)亡因子tf15基因 lan