專題22土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)課件高二生物同步精品課堂提升版選修1

1、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)選修選修1 1專題專題2 2課題課題2 2一、研究思路一、研究思路 （一）篩選菌株（一）篩選菌株1.1.實例：實例：pcrpcr技術(shù)：一種在體外將少量技術(shù)：一種在體外將少量dnadna大量復(fù)制的技術(shù)。此項技術(shù)大量復(fù)制的技術(shù)。此項技術(shù)要求使用耐高溫的要求使用耐高溫的dnadna聚合酶。聚合酶。提出的問題提出的問題如何尋找如何尋找耐高溫耐高溫的的dnadna聚合酶？聚合酶？ 解決問題的思路解決問題的思路尋找尋找耐高溫耐高溫環(huán)境。環(huán)境。原因：原因：高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物。高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物。獲得啟示：獲得啟示：尋找目的菌

2、種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。境中去尋找。2.2.實驗室微生物的篩選原理實驗室微生物的篩選原理人為提供有利于目的菌株生長的條件人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、（包括營養(yǎng)、溫度、phph等），等），同時抑制或阻止其他微生物生長。同時抑制或阻止其他微生物生長。本課題使用的培養(yǎng)基本課題使用的培養(yǎng)基khkh2 2popo4 4 1.4g 1.4g nahpo nahpo4 4 2.1g 2.1g mgso mgso4 4 .7h .7h2 2o 0.2go 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素

3、1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到餾水定容到1000ml1000ml。碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌才能利用尿素作能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源而生存。為氮源而生存。3.3.選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基問題問題1 1：該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？問題問題2 2：此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？為什么？在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生在

4、微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基（1 1）概念：）概念：（2 2）例子：）例子：細菌不生長，細菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長。酵母菌、霉菌等真菌能生長。不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基 分離分離自養(yǎng)型微生物。自養(yǎng)型微生物。 【典型例題典型例題】用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是的對照是( () )a.a.未接種的選擇培養(yǎng)基未接種的選擇培養(yǎng)基b.

5、b.未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基c.c.接種了的選擇培養(yǎng)基接種了的選擇培養(yǎng)基d.d.接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基d d【變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練】苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，為土壤樣品。請回答下列問題：的主要步驟如圖所示

6、，為土壤樣品。請回答下列問題：(1)(1)中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應(yīng)加入中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應(yīng)加入_作為碳源，作為碳源，中不同濃度碳源的培養(yǎng)基中不同濃度碳源的培養(yǎng)基_(a._(a.影響；影響；b.b.不影響不影響) )細菌的數(shù)量，細菌的數(shù)量，如果要測定中活細菌數(shù)量，常采用如果要測定中活細菌數(shù)量，常采用_法。法。(2)(2)為對照，微生物在中不生長，在中生長，與培養(yǎng)基的為對照，微生物在中不生長，在中生長，與培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于主要區(qū)別在于_ ；使用使用_法可以在上獲得單菌落。法可以在上獲得單菌落。采用固體平板培養(yǎng)細菌時進行倒置培養(yǎng)的原因是采用固體平板培養(yǎng)細菌時進行倒置培養(yǎng)的原因是_。

7、(3)(3)實驗過程中如何防止其他微生物的污染？實驗過程中如何防止其他微生物的污染？_。苯酚苯酚a a稀釋涂布平板稀釋涂布平板的培養(yǎng)基沒有加入苯酚作為碳源，的培養(yǎng)基沒有加入苯酚作為碳源，的培養(yǎng)基加的培養(yǎng)基加入了苯酚作為碳源入了苯酚作為碳源稀釋涂布平板法或平板劃線稀釋涂布平板法或平板劃線防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，接種過程進行無菌操作培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，接種過程進行無菌操作（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目1.1.顯微鏡直接計數(shù)顯微鏡直接計數(shù)(1)(1)原理原理: :利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，

8、在顯微鏡下計算一定利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量容積的樣品中微生物的數(shù)量。(2)(2)具體做法具體做法：（3 3）優(yōu)缺點：）優(yōu)缺點：缺點：缺點：不能區(qū)分死菌和活菌。不能區(qū)分死菌和活菌。優(yōu)點：優(yōu)點：能準確統(tǒng)計微生物的實際數(shù)目。能準確統(tǒng)計微生物的實際數(shù)目。每一個大方格邊長為每一個大方格邊長為 1mm 1mm ，則每一大方格的面積為，則每一大方格的面積為1mm1mm2 2，蓋上蓋玻片，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm0.1mm，所以計數(shù)室的容積為，所以計數(shù)室的容積為0.1mm0.1mm3 3。以一個大方格

9、有以一個大方格有2525個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設(shè)五個中方格中個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為總菌數(shù)為a a，菌液稀釋倍數(shù)為，菌液稀釋倍數(shù)為b b，一個大方格中的總菌數(shù)是多少，一個大方格中的總菌數(shù)是多少? ? 5a5a1ml1ml菌液中的總菌數(shù)菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm?(1ml=1cm3 3=1000mm=1000mm3 3）5ab5ab10104 41mm1mm2.2.間接計數(shù)（活菌計數(shù)法）間接計數(shù)（活菌計數(shù)法）c c代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，v v代表涂布平板時所代表涂布平板時所用的稀釋液的體積用的稀釋

10、液的體積( (m m) )，m m代表稀釋倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。 當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。含有多少活菌。（2 2）原理：）原理：（1 1）常用方法：）常用方法：計算公式：計算公式：【例例1 1】某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基上測得平板上的菌落數(shù)的平的培養(yǎng)基上測得平板上的菌落數(shù)的平均值為均值為234234，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布

11、平板時所用稀釋液的，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為體積為0.1 ml0.1 ml）（）（ ） a.2.34 a.2.3410108 8b.2.34b.2.3410109 9 c.234c.234d.23.4d.23.4（3 3）計數(shù)）計數(shù)【解析解析】稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)為10106 6，0.1 ml0.1 ml稀釋液的菌落數(shù)的平均值為稀釋液的菌落數(shù)的平均值為234234，則每，則每毫升樣品中菌落數(shù)就為毫升樣品中菌落數(shù)就為234/0.1234/0.110106 6= =2.342.3410109 9。b b例例2 2】：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。兩

12、位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230230。 2 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了、乙同學(xué)在該濃度下涂布了a a、b b、c c三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為為2121、212212、256256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163163作為統(tǒng)計結(jié)作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題

13、，錯在哪？果。你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有甲：沒有重復(fù)實驗重復(fù)實驗（至少涂布（至少涂布3 3個平板）。個平板）。乙：乙：a a組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值。組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值。為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在3030030300的平板上進行計數(shù)。的平板上進行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。比活菌的實際數(shù)目低。涂

14、布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在平均菌落數(shù)在5050個個左右為最好。左右為最好。稀釋涂布平板法計算注意事項稀釋涂布平板法計算注意事項1.1.土壤取樣土壤取樣2.2.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基3.3.樣品稀釋、取樣涂布樣品稀釋、取樣涂布4 4. .微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果5 5. .細菌的計數(shù)細菌的計數(shù)二、實驗設(shè)計二、實驗設(shè)計1.1.土壤取樣土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，

15、將樣品左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。裝入事先準備好的信封中。2.2.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。選用稀釋倍數(shù)為選用稀釋倍數(shù)為10103 310107 7的稀釋液。每個稀釋度下需要的稀釋液。每個稀釋度下需要3 3個選擇培養(yǎng)基個選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)原則），（平行重復(fù)原則），1 1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要制備制備5 5個牛肉膏個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和蛋白胨培養(yǎng)基和1515個選擇培養(yǎng)基，個選擇培養(yǎng)基，準備好無菌試管和移液管。準備好無菌試管和移液管。

16、3.3.樣品稀釋、取樣涂布樣品稀釋、取樣涂布測定土壤細菌數(shù)量，一般選用測定土壤細菌數(shù)量，一般選用10104 4、10105 5和和10106 6倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)；倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)；測定放線菌的數(shù)量，一般選用測定放線菌的數(shù)量，一般選用10103 3、10104 4和和10105 5倍稀釋液；測定真菌的數(shù)倍稀釋液；測定真菌的數(shù)量，一般選用量，一般選用10102 2、10103 3和和10104 4倍稀釋液。倍稀釋液。因為土壤中各類微生物的因為土壤中各類微生物的數(shù)量是不同的，數(shù)量是不同的，為獲得不同類型的微生物，為獲得不同類型的微生物，就需要按就需要按不同的稀釋度不同的稀釋度進行分離，同

17、時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。養(yǎng)的條件。將將10g10g土樣加入盛有土樣加入盛有90ml90ml無菌生理鹽水的錐形瓶中無菌生理鹽水的錐形瓶中, ,充分搖勻，吸取上充分搖勻，吸取上清液清液1ml1ml，轉(zhuǎn)移至盛有，轉(zhuǎn)移至盛有9ml9ml水的無菌試管中，依次等比稀釋至水的無菌試管中，依次等比稀釋至10107 7稀釋稀釋度，并按照由度，并按照由10107 7至至10103 3稀釋度的順序分別吸取稀釋度的順序分別吸取0.1ml0.1ml進行進行平板涂布操平板涂布操作作。按照濃度從。按照濃度從低到高的順序涂布平板低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。，不必

18、更換移液管。注意：注意：由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。4 4. .微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果將涂布好的培養(yǎng)皿放在將涂布好的培養(yǎng)皿放在3030下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細細菌菌一般在一般在30373

19、037的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)12d12d；放線菌放線菌一般在一般在25282528的的溫度下培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)57d57d；而；而霉菌霉菌一般在一般在25282528的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)34d34d。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下( (相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間間) )，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如菌落，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如菌落形狀、大小、隆形狀、大小、隆起程度和顏色。起程度和顏色。5.細菌的計數(shù)細菌的計數(shù)當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在3030030300的的平板進行計數(shù)。在同一平板進行計

20、數(shù)。在同一稀釋度下，至少對稀釋度下，至少對3 3個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目?！镜湫屠}典型例題】在做分離在做分離“分解尿素的細菌分解尿素的細菌”實驗時，實驗時，a a同學(xué)從對應(yīng)同學(xué)從對應(yīng)10106 6培養(yǎng)基培養(yǎng)基中篩選出大約中篩選出大約150150個菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約個菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約5050個菌個菌落下列有關(guān)敘述不正確的是（）落下列有關(guān)敘述不正確的是（）a. aa. a同學(xué)出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是土樣不同同學(xué)出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是

21、土樣不同b. b. 可以將可以將a a同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)作為同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染c. c. 讓其他同學(xué)用與讓其他同學(xué)用與a a同學(xué)一樣的土壤進行實驗，如果結(jié)果與同學(xué)一樣的土壤進行實驗，如果結(jié)果與a a同同學(xué)一樣，則可證明學(xué)一樣，則可證明a a同學(xué)無誤同學(xué)無誤d. bd. b選項的實驗思路都遵循了實驗的對照原則，而選項的實驗思路都遵循了實驗的對照原則，而c c選項的沒有選項的沒有d d【變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練】下列關(guān)于下列關(guān)于“檢測土壤中細菌總數(shù)檢測土壤中細菌總數(shù)”實驗操作的敘述中，不

22、正確的實驗操作的敘述中，不正確的是是( () )a.a.用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后倒平板用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后倒平板b.b.取取10104 4、10105 5、10106 6倍的土壤稀釋液和無菌水各倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 ml0.1 ml涂布到不同涂布到不同平板上培養(yǎng)平板上培養(yǎng)c.c.將實驗組和對照組平板倒置，將實驗組和對照組平板倒置，37 37 恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)24244848小時小時d.d.確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300300以上的平板進行計數(shù)以上的平板進行計數(shù)d d【方法點撥方法點撥】一般選擇菌落數(shù)在一般選擇菌落數(shù)在3030300300間的平板進行計數(shù)間的平板進行計數(shù)【課堂小結(jié)課堂小結(jié)】一、一、選擇培養(yǎng)基的成分：選擇培養(yǎng)基的成分：分解尿素細菌的分離與計數(shù)分解尿素細菌的分離與計數(shù)尿素作為唯一的氮源尿素作為唯一的氮源。二、二、鑒定方法：鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，phph升高，說明細菌能分解尿素升高，說明細菌能分解尿素。三、三、統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法（1 1）顯微鏡直接計數(shù)法）顯微鏡直接計數(shù)法（2 2）間接計數(shù)法）間接計數(shù)法（稀釋涂布平板計數(shù)法）（稀釋涂布平板計數(shù)法）計算公式計算公式