食品分《蛋白質及氨基酸含量的測定》(第9章)

1、浙江科技學院浙江科技學院生物與化學工程學院生物與化學工程學院 劉鐵兵劉鐵兵歡迎各位 同學和朋友！浙江科技學院浙江科技學院 生物與化學工程學院生物與化學工程學院劉劉 鐵鐵 兵兵食品分析 1、蛋白質是食品中三大營養(yǎng)素之一；蛋白質對食品的色、香、味及組織結構等具有重要意義；一些蛋白質具有生物活性功能，是開發(fā)功能性食品原料之一；蛋蛋 白白 質質 概概 述述 2、蛋白質中氮元素的含量：16%（平均），蛋白質系數(shù)：6.25；蛋白質水解產物：胨、肽、氨基酸等；構成蛋白質的氨基酸：20種，自然界氨基酸有175種以上；八種人體必須氨基酸：Leu, Ile, Phe, Met, Val, Lys, Trp, Th

2、r ； 3、蛋白質常用測定方法：凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結合法、Folin酚試劑法、紫外吸收法等； 4、氨基酸常用的測定方法：酸堿滴定法、色譜法（GC、HPLC）、氨基酸分析儀等； 蛋白質是生命的物質基礎，人體11%13%總熱量來自蛋白質。無論動物、植物都含有蛋白質，只是含量及類型不同。 蛋白質是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白質，可能還包括有非蛋白質含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。 一般說來，動物性食品的蛋白質含量高于植物性食品

3、。例如牛肉中蛋白質含量為 20.0%左右，豬肉 9.5%，兔肉 21%，雞肉 20%，牛乳 3.5%，帶魚 18.0%，大豆 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%，黃瓜 1.0%，蘋果 1.4%。 測定食品中的蛋白質的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產品質量、優(yōu)化食品配方、指導經濟核算及生產過程控制均具有極其重要的意義。微量凱氏定氮法測定蛋白質含量微量凱氏定氮法測定蛋白質含量樣品以硫酸銅為催化劑，用濃硫酸消化，使有機氮轉變成無機氨并與硫酸結合生成硫酸銨，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以標準鹽酸溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計算出氨含量，再乘以蛋白質系數(shù)即為蛋白質含量。

4、該法適合于各類食品中蛋白質的測定。樣品消化蒸餾吸收滴定基本原理：基本原理：基本步驟：基本步驟：為了加速蛋白質消化，縮短消化時間，常加入下列物質： K2SO4：可以提高溶液的沸點；使硫酸的沸點從340度升高至400度以上；但加入量不可太多，否則消化體系溫度過高引起生成的銨鹽分解而損失氨；也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。22 2244242222()13()61216NH CHCOOHH SONHSOCOSOH O42434444322()NHSONHNH HSONH HSONHSOH O樣品消化： CuSO4：催化劑；同時可指示消化終點到達的功能，還可以加氧化汞、汞（均有毒，

5、價格貴）、硒粉、二氧化鈦。蒸餾：在消化完全的樣品中加入濃NaOH使呈堿性，即放出氨氣；吸收與滴定：放出的氨用硼酸溶液吸收，后用鹽酸標準溶液滴定形成的硼酸銨：批示劑為：1:5的甲基紅乙醇與溴甲酚綠乙醇。 4242242422242442222CuSOCu SOSOOCCuSOCu SOCOSOCu SOH SOCuSOH OSO4243242()222NHSONaOHNHNa SOH O 2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 5H2O(NH4)2B4O7 + 5H2O + 2HCl = 2NH4Cl + 4 H3BO3凱氏定氮消化裝置：凱氏定氮蒸餾裝置：16%N= N6.25

6、 = 折算蛋白質含量折算蛋白質含量一些蛋白質的含氮量為 15%17.6%，有的上下浮動，可以測出總氮 N。凱氏定氮法的折算方法：由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法、半微量法及改良凱氏法。 1）所用試劑均為無氨蒸餾水配制； 2）消化時應保持微沸； 3）消化時要轉動消化瓶； 4）由于糖或脂肪多，加熱時會產生大量泡沫，可加入消 泡劑并開始小火加熱； 5）較難消化時，可冷卻后加入氧化劑如30%過氧化氫、次 氯酸鉀等繼續(xù)消化，加速有機物氧化速度。 6）取樣量增加時，硫酸用量也應增加； 7）一般消化呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可。凱氏定氮說明： 8）蒸餾裝置不能漏氣； 9）

7、蒸餾前加堿后若溶液呈藍色而不沉淀，則說明堿 不足，應再加； 10）硼酸吸收液的溫度不可超過40； 11）蒸餾完成后先將冷凝管下端提出液面，繼續(xù)蒸餾 1分鐘后再關熱源，否則會造成倒吸； 12）混合指示劑在堿性中呈綠色、在中性中呈灰色、 在酸性中呈紅色； 13）吸收液也可用硫酸，過多的硫酸用標準NaOH滴 定。凱氏定氮說明：1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。微量凱氏定氮法：雙縮脲法測定蛋白質含量雙縮脲法測定蛋白質含量 含有肽鍵的蛋白質與雙縮脲結構相似，也能與堿及少量的硫酸銅溶液作

8、用生成紫紅色的配合物，此反應稱為雙縮脲反應，此配合物在560nm有最大吸收；適用范圍與特點： 靈敏度低、操作簡單、快速；生物化學中應用較多，也適用于作物種子與肉類樣品的測定；說明：1）蛋白質的種類對發(fā)色影響不大；2）脂肪多的樣品先脫脂；3）樣品中有不溶性成分時，對比色不利；4）蛋白質肽鏈有脯氨酸時，若有多糖存在則顯色不好，結果偏低?；驹恚弘澹蛩兀㎞H2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物，這種反應叫雙縮脲反應。（縮二脲反應）蛋白質分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反應，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質

9、含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2CONH2 + NH2CONH2NH2CONHCONH2 + NH3本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。方法特點及應用范圍紫紫 外外 吸吸 收收 法法 測測 定定 蛋蛋 白白 質質 含含 量量 1）在測定乳品時，以醋酸代替檸檬酸；并用微量凱氏定法測定的乳品作為標準品做標準曲線；2）測定糕點時，應將表皮的顏色去掉；3）溫度對蛋白質水解有影響，故操作溫度控制在20-30。基本原理：基本原理： 主要用于生物化學中測定；由于食品中干擾成分

10、較多，應用受到限制。適用范圍與特點：適用范圍與特點： 組成蛋白質的氨基酸含有芳香環(huán)時，在紫外區(qū)具有強烈的光吸收；在280nm下光吸收程度與蛋白質濃度（3-8mg/ml）呈正比；Tyr：275nm Trp：280nm Phe：259nm說明：說明：R R（ NH NHCHCHCOCO）利用蛋白質的特有基團染料結合法測定蛋白質含量染料結合法測定蛋白質含量 牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品中蛋白質測定； 1）取樣要均勻；2）標準曲線可長期使用；3）脂肪含量多時，樣品應先脫脂； 4）樣品溶解性不好時可用此法； 5）染料除此之外，還有橙黃G和溴酚藍等?；驹恚?蛋白質與某些染料（如胺黑1

11、0B）能定量結合生成沉淀，用分光光度法測定余下的染料量即可算出與染料結合的蛋白質的量；適用范圍與特點：說明：氨基酸態(tài)氮的測定氨基酸態(tài)氮的測定 氨基酸具有兩性，加入的甲醛與氨基反應使平衡向解離方向移動，即羧基解離出H+ ， 然后用標準堿滴定H+，根據(jù)消耗的堿量算出氨基酸的量； pKa2HCHOHCHO基本原理：基本原理：適用范圍與特點：適用范圍與特點： 此法簡單、快速、方便；發(fā)酵工業(yè)中用來測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化；Pro與甲醛作用產生不穩(wěn)定化合物使結果偏低；Tyr有酚羥基而消耗少量堿使結果偏高；氨基酸態(tài)氮的測定氨基酸態(tài)氮的測定 1）測定的是游離氨基酸； 2）固體樣品先熱水提??；液體樣品直接滴

12、定； 3）樣液顏色深時先脫色（活性炭）或用電位滴定（先滴定到pH8.2，記下體積，繼續(xù)滴定至pH9.2，二者體積之差即為氨基酸消耗的堿液體積） 4）也可用一種指示劑（百里酚酞），但結果沒有雙指示劑（百里酚酞，中性紅）準確； 5）加入甲醛后應立即滴定，不宜放置時間過長，以免甲醛聚合而影響測定結果； 6）樣品中若有銨鹽會因銨鹽與甲醛作用而使結果偏高。說明：揮發(fā)性氨基氮的測定揮發(fā)性氨基氮的測定 揮發(fā)性氨基氮在測定時遇弱堿氧化鎂即被游離而蒸餾出來，餾出的氨被硼酸吸收后生成硼酸銨，使吸收液變?yōu)閴A性，混合指示劑（甲基紅、次甲基藍）由紫色變成綠色。然后由鹽酸滴定，當溶液再次由綠色返回至紫色時即為滴定終點。根

13、據(jù)鹽酸消耗量可算出揮發(fā)性氨基氮的含量。 揮發(fā)性氨基氮是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中，因蛋白質分解而產生的氨及胺類等堿性含氮物質。揮發(fā)性氨基氮是評價肉及肉制品、水產品等鮮度的主要衛(wèi)生指標，揮發(fā)性氨基氮常用半微量定氮法測定。 基本原理：基本原理：蛋白質氮和非蛋白質氮的測定蛋白質氮和非蛋白質氮的測定 利用蛋白質能與重金屬離子（如Cu2+、Hg2+、Pb2+等）結合形成蛋白質鹽而變性沉淀的特性，在一定條件下將蛋白質氮和非蛋白質氮分離，然后用凱氏定氮法分別測定。基本原理基本原理：（1）醋酸銅作沉淀劑：）醋酸銅作沉淀劑：原理：樣品用水消化，用醋酸銅沉淀蛋白質，非蛋白質則留存于溶液中，過濾后

14、，用凱氏定氮法分別測定沉淀和濾液中的氮含量。蛋蛋 白白 質質 氮氮 和和 非非 蛋蛋 白白 質質 氮氮 的的 測測 定定原理：樣品經粉碎后加水磨至均勻后，轉入離心管中，以Cu(OH)2沉淀蛋白質，離心分離，并用蒸餾水洗滌。用凱氏定氮法分別測定溶液中的非蛋白氮和沉淀中的蛋白質氮。（2）用）用Cu(OH)2作沉淀劑：作沉淀劑：原理原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，成中性內鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結合，堿性消失，再用強堿來滴定 COOH 基。特點特點：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）氨氨 基基 酸酸 的的

15、 一一 般般 定定 量量 測測 定定1、甲醛滴定法、甲醛滴定法 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性紅50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氫氧化鈉標準溶液。操作：同時取兩份樣， + 中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質。 + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質的總和。二者之差可計算氨基酸含量。雙指示劑：1 1、薄層色譜法（薄層層析法（、薄層色譜法（薄層層析法（TLC TLC 法）法）Thin Layer Thin Layer ChromatographyC

16、hromatography簡介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達到分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進行，所以稱為薄層層析。它的應用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農藥殘留量、黃曲霉毒素等。2、茚三酮比色法、茚三酮比色法原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應，生成藍紫色化合物，可定量比色。氨基酸的分離與測定氨基酸的分離與測定 取一定量經水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的R

17、f值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。原 理：Rf = a / bab溶劑前沿溶劑前沿樣樣 點點點樣原點點樣原點 展開時間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10100倍） 精確到0.01ug。 也可用于大量分離500 mg，作為樣品制備層析。缺點：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。優(yōu) 點： 薄層板制備

18、樣品液制備 點樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標記作為原點。再以點樣距扳子寬窄可點幾個點同時展開，點與點之間間隔12cm。a.可用毛細玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一個點干了再點另一個點。b.用一小直徑3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到板子上先挖好一個小洞穴。操作方法：展開：點樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度1030，下端浸入展開劑1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。展開劑的有關情況：主要是低沸點的23種有機溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因為吸附劑在一定情況下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠遠小于展開劑的選擇。.微量圓環(huán)法。.用小載玻片試驗，微量展開劑展開5cm。.圖解法：樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。 有機溶劑極性由小到大為： 石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有機酸類等。展開劑