推薦4PCR技術(shù)

1、12pcr技術(shù)技術(shù)(1)概念：在概念：在_快速擴(kuò)增快速擴(kuò)增_的實(shí)驗(yàn)技術(shù)稱為的實(shí)驗(yàn)技術(shù)稱為pcr技術(shù)。技術(shù)。(2)物質(zhì)條件物質(zhì)條件體外進(jìn)行體外進(jìn)行dna復(fù)制的各種組成成分有：復(fù)制的各種組成成分有：_、_、_、_。(3)pcr的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程pcr一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為_和和_(72 左右左右)。體外體外特定基因或特定基因或dna序列序列(目的目的dna片段片段)dna模板模板四種四種脫氧核苷酸脫氧核苷酸t(yī)aq聚合酶聚合酶引物引物變性變性(94 )、退火、退火(4060 )延伸延伸34細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制與體外復(fù)制與體外dna擴(kuò)增擴(kuò)增(p

2、cr技術(shù)技術(shù))的比較的比較1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制復(fù)制pcr不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80100 高溫解旋，高溫解旋，雙鏈完全分開雙鏈完全分開酶酶解旋酶，解旋酶，dna聚合酶，聚合酶，dna連接酶連接酶taq聚合酶聚合酶引物引物rnadna或或rna能量能量atp不加不加溫度溫度體內(nèi)溫和條件體內(nèi)溫和條件高溫高溫子鏈子鏈合成合成一條鏈連續(xù)一條鏈連續(xù)(先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈)，另一條，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再鏈不連續(xù)，先合成片段，再由由dna連接酶連接連接酶連接(滯后鏈滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成兩條子鏈均連續(xù)合成5相相同同點(diǎn)點(diǎn)提供提供dna模板模板四種脫氧核苷酸作原料

3、四種脫氧核苷酸作原料子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端6引物引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)原則1、引物決定著擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的效率、引物決定著擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的效率2、引物設(shè)計(jì)影響到后續(xù)載體構(gòu)建的效率、引物設(shè)計(jì)影響到后續(xù)載體構(gòu)建的效率3、引物設(shè)計(jì)影響到實(shí)驗(yàn)的成本、引物設(shè)計(jì)影響到實(shí)驗(yàn)的成本引物設(shè)計(jì)軟件引物設(shè)計(jì)軟件 primer premier 4.11 oligo 6.07數(shù)量數(shù)量：2個(gè)（一對）個(gè)（一對）長度長度一般在一般在1630個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸，至少為，至少為16個(gè)核苷酸，不超過個(gè)核苷酸，不超過38個(gè)個(gè)指與模板鏈完全配對的堿基數(shù)指與模板鏈完全配對的堿基數(shù)太短太短：特異性差：特異性

4、差太長太長：自身折疊形成二級結(jié)構(gòu)；：自身折疊形成二級結(jié)構(gòu)；tm過高，不利于與模板穩(wěn)固配對，難以形成擴(kuò)增起始二級結(jié)構(gòu)。過高，不利于與模板穩(wěn)固配對，難以形成擴(kuò)增起始二級結(jié)構(gòu)。8順序順序應(yīng)是所要應(yīng)是所要擴(kuò)增基因特異的順序擴(kuò)增基因特異的順序若要進(jìn)行個(gè)體間的比較，若要進(jìn)行個(gè)體間的比較，應(yīng)選擇保守同一的順序來設(shè)計(jì)引物應(yīng)選擇保守同一的順序來設(shè)計(jì)引物堿基組成堿基組成gc為為4060atgc最好隨機(jī)分布最好隨機(jī)分布9防止引物自身形成二級結(jié)構(gòu)防止引物自身形成二級結(jié)構(gòu) 一對引物的順序不應(yīng)自身互補(bǔ)一對引物的順序不應(yīng)自身互補(bǔ) 特別要避免特別要避免3-端的重疊，以免形成二聚體等特異的擴(kuò)增條帶端的重疊，以免形成二聚體等特異

5、的擴(kuò)增條帶防止發(fā)卡結(jié)構(gòu)防止發(fā)卡結(jié)構(gòu) 、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu) ！10 下圖為某一次循環(huán)的產(chǎn)物，請據(jù)圖回答問題。下圖為某一次循環(huán)的產(chǎn)物，請據(jù)圖回答問題?！眷柟天柟? 1】 (1)pcr一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為_、_、_三個(gè)步驟。三個(gè)步驟。(2)dna的羥基的羥基(oh)末端稱為末端稱為_，圖中所示的羥，圖中所示的羥基端為基端為_(填字母填字母)。(3)pcr技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制在解旋時(shí)原理不同：細(xì)胞復(fù)制在解旋時(shí)原理不同：細(xì)胞內(nèi)復(fù)制利用內(nèi)復(fù)制利用_使雙鏈間氫鍵斷裂，而使雙鏈間氫鍵斷裂，而pcr技術(shù)利用技術(shù)利用_原理，使雙鏈氫鍵斷裂。以引

6、物為標(biāo)識，可判斷原理，使雙鏈氫鍵斷裂。以引物為標(biāo)識，可判斷出此產(chǎn)物最早為第出此產(chǎn)物最早為第_次循環(huán)的產(chǎn)物。次循環(huán)的產(chǎn)物。11聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr技術(shù)技術(shù))是體外酶促合成特異是體外酶促合成特異dna片段片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的dna得以迅速擴(kuò)增，其簡要過程如下圖得以迅速擴(kuò)增，其簡要過程如下圖所示。下列關(guān)于所示。下列關(guān)于pcr技術(shù)的敘述，不正確的是技術(shù)的敘述，不正確的是 ()?！眷柟天柟? 2】 apcr技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室

7、中以少量dna制備大量制備大量dna的技術(shù)的技術(shù)b反應(yīng)中新合成的反應(yīng)中新合成的dna又可以作為下一輪反應(yīng)的模板又可以作為下一輪反應(yīng)的模板cpcr技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增d應(yīng)用應(yīng)用pcr技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變12 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是一種體外迅速擴(kuò)增是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段片段的技術(shù)。的技術(shù)。pcr過程一般經(jīng)歷過程一般經(jīng)歷30多次下述循環(huán)：多次下述循環(huán)：94 條件條件下使模板下使模板dna變性、解鏈變性、解鏈56 條件下退火條件下退火(引物與引物與dna模板鏈結(jié)合模板鏈結(jié)

8、合)72 條件下引物鏈延伸條件下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷形成新的脫氧核苷酸鏈酸鏈)。下列有關(guān)。下列有關(guān)pcr過程的敘述，不正確的是過程的敘述，不正確的是 ()?！纠?】示例示例一一pcr技術(shù)及應(yīng)用技術(shù)及應(yīng)用13a變性過程中破壞的是變性過程中破壞的是dna分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵， 也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)b退火過程中引物與退火過程中引物與dna模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ) 配對原則完成的配對原則完成的c延伸過程中需要延伸過程中需要dna聚合酶、聚合酶、atp、4種核糖核苷酸種核糖核苷酸dpcr與細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制相比，其所需

9、要酶的最適溫度復(fù)制相比，其所需要酶的最適溫度 較高較高思維導(dǎo)圖：思維導(dǎo)圖：14 下列有關(guān)下列有關(guān)pcr技術(shù)的敘述，不正確的是技術(shù)的敘述，不正確的是()。a又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段片段 的技術(shù)的技術(shù)b在用在用pcr技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增dna時(shí)，時(shí)，dna的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi) dna的復(fù)制類似的復(fù)制類似cpcr反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供dna模板以及模板以及 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸dpcr一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、退一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、退 火、延伸火、

10、延伸【變式拓展變式拓展1】15 進(jìn)行目的進(jìn)行目的dna片段的體外擴(kuò)增，下列選項(xiàng)不需片段的體外擴(kuò)增，下列選項(xiàng)不需要的是要的是 ()。adna聚合酶聚合酶 b解旋酶解旋酶cmg2 d引物引物解析解析dna體外擴(kuò)增是利用的體外擴(kuò)增是利用的dna熱變性原理，不需解熱變性原理，不需解旋酶。旋酶。答案答案b【變式拓展變式拓展2】16下列關(guān)于下列關(guān)于dna復(fù)制敘述中，正確的是復(fù)制敘述中，正確的是 ()。adna聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成dna，只能從，只能從5端延伸端延伸 dna鏈鏈bdna復(fù)制不需要引物復(fù)制不需要引物c引物與引物與dna母鏈通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行結(jié)合母鏈通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行

11、結(jié)合ddna的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的3端向端向5端延伸端延伸解析解析本題主要考查了本題主要考查了dna聚合酶的作用特點(diǎn)。由于聚合酶的作用特點(diǎn)。由于dna聚聚合酶不能從頭開始合成合酶不能從頭開始合成dna，只能從引物的，只能從引物的3端延伸端延伸dna鏈。鏈。由于模板鏈?zhǔn)紫葟?fù)制的是由于模板鏈?zhǔn)紫葟?fù)制的是3端，即復(fù)制方向端，即復(fù)制方向35，而，而dna分分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對原則，在子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對原則，在dna聚聚合酶作用下合成的，其合成方向從子鏈合酶作用下合成的，其合成方向從子鏈53。答案答案c1.17pcr利用了利用了dna熱變性的

12、原理，熱變性的原理，pcr儀實(shí)際上是一種能儀實(shí)際上是一種能自動調(diào)節(jié)溫度的儀器。下列對自動調(diào)節(jié)溫度的儀器。下列對pcr過程中溫度的控制的說過程中溫度的控制的說法錯(cuò)誤的是法錯(cuò)誤的是 ()。a酶促反應(yīng)需要高溫，是為了保證模板是單鏈酶促反應(yīng)需要高溫，是為了保證模板是單鏈b延伸的溫度必須高于退火的溫度，而低于變性的溫度延伸的溫度必須高于退火的溫度，而低于變性的溫度c要用耐高溫的要用耐高溫的dna聚合酶聚合酶d需要耐高溫的解旋酶需要耐高溫的解旋酶解析解析pcr是體外是體外dna擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增技術(shù)，dna雙鏈的解開不需雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其變性。要解旋酶，靠高溫使其變性。答案答案d218a向右的

13、過程為加熱向右的過程為加熱(80100 )變性的過程變性的過程b向左的過程是向左的過程是dna雙鏈迅速制冷退火雙鏈迅速制冷退火c變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同d圖中圖中dna片段共有片段共有4個(gè)游離的磷酸基、個(gè)游離的磷酸基、4個(gè)個(gè)3端端解析解析變性后的變性后的dna在緩慢降溫后才會退火；變性與在生在緩慢降溫后才會退火；變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件不同，實(shí)質(zhì)相同；任一物體內(nèi)解旋過程的條件不同，實(shí)質(zhì)相同；任一dna片段都片段都有有2個(gè)游離的磷酸基個(gè)游離的磷酸基(5端端)和和2個(gè)個(gè)3端。端。答案答案a下圖為下圖為dna變性和退火示意圖，下列相關(guān)

14、說法正確的是變性和退火示意圖，下列相關(guān)說法正確的是 ()。319pcr一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物延伸而成的延伸而成的dna單鏈做模板時(shí)將單鏈做模板時(shí)將 ()。a仍與引物仍與引物結(jié)合進(jìn)行結(jié)合進(jìn)行dna子鏈的延伸子鏈的延伸b與引物與引物結(jié)合進(jìn)行結(jié)合進(jìn)行dna子鏈的延伸子鏈的延伸c同時(shí)與引物同時(shí)與引物和引物和引物結(jié)合進(jìn)行子鏈延伸結(jié)合進(jìn)行子鏈延伸d無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈解析解析此題考查同學(xué)們對此題考查同學(xué)

15、們對pcr反應(yīng)中的變性、退火、延伸反應(yīng)中的變性、退火、延伸的實(shí)質(zhì)能否真正理解。當(dāng)由引物的實(shí)質(zhì)能否真正理解。當(dāng)由引物延伸而成的延伸而成的dna單鏈做單鏈做模板時(shí)，此單鏈引物端為模板時(shí)，此單鏈引物端為5端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即由引物另一端開始合成，即由引物結(jié)合延伸結(jié)合延伸dna子鏈。子鏈。答案答案b420在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品dna進(jìn)行分析，進(jìn)行分析，pcr技術(shù)能快速擴(kuò)增技術(shù)能快速擴(kuò)增dna片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的的dna拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分锌截?，有效地解決了因?yàn)闃悠分衐na含量太低而難含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題。以對樣品進(jìn)行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題。521(1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物在相應(yīng)的橫線上寫出引物，并在復(fù)性這一步驟中將引物，并在復(fù)性這一步驟中將引物置于合適的位置。置于合適的位置。(2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的dna分子。分子。(3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32p標(biāo)記，請分析