醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)

1、醋酸纖維薄膜電泳分離血醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)清蛋白質(zhì)山西大學(xué)生科院生化教研室一、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理二、二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定現(xiàn)象。在一定phph條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)而條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，

2、因此，可使它們分動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離離影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的phph值、溶液的值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀小和形狀采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無拖尾醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象

3、等優(yōu)點(diǎn)和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120 120 m m，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中

4、含有清蛋白、清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在ph8.6ph8.6的緩沖體系的緩沖體系中電泳，染色后可顯示中電泳，染色后可顯示5 5條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動(dòng)速度最快，其余依條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動(dòng)速度最快，其余依次為次為1-1-、2-2-、-及及-球蛋白球蛋白實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材v1.dyy-2

5、1.dyy-2型常型常壓電泳儀：北京壓電泳儀：北京市六一儀器廠生市六一儀器廠生產(chǎn)，產(chǎn)，1 1套套/2/2組。組。 v操作指南：電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組操作指南：電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，兩者之間有專門的連線連接。電泳槽有兩個(gè)成，兩者之間有專門的連線連接。電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭動(dòng)的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調(diào)浸入緩沖

6、液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長(zhǎng)度，點(diǎn)好樣的醋酸纖節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長(zhǎng)度，點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上，。穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓維薄膜就搭在濾紙橋上，。穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓和通電時(shí)間。當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點(diǎn)和通電時(shí)間。當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點(diǎn)好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，通好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，通電，調(diào)整好電壓，進(jìn)行電泳。注意電泳槽的電極方電，調(diào)整好電壓，進(jìn)行電泳。注意電泳槽的電極方向，負(fù)極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點(diǎn)樣原點(diǎn)在同一側(cè)。向，負(fù)極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點(diǎn)樣原點(diǎn)在同一側(cè)。目前，該電泳儀已改進(jìn)為數(shù)顯式的目

7、前，該電泳儀已改進(jìn)為數(shù)顯式的dyy-6cdyy-6c型。型。 v2.2.醋酸纖維薄膜（醋酸纖維薄膜（2 2 cmcm8cm8cm）：）：2 2片片/ /人。人。 v3.3.培養(yǎng)皿：一排桌子培養(yǎng)皿：一排桌子（即（即4 4組）公用組）公用5 5套，包套，包括平衡、染色各用一套，括平衡、染色各用一套，漂洗用漂洗用3 3套。套。 v4.4.點(diǎn)樣器：一個(gè)點(diǎn)樣器：一個(gè)/ /組。組。 v5.5.濾紙：公用。濾紙：公用。 v6.6.玻璃板：一塊玻璃板：一塊/ /組。組。 v7.7.鑷子：一個(gè)鑷子：一個(gè)/ /組。組。 v8.8.玻棒：公用。玻棒：公用。 四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑v1 1巴比妥緩沖液（巴比妥緩沖液

8、（ph8.6ph8.6，離子強(qiáng)度，離子強(qiáng)度0.070.07）：巴比）：巴比妥妥2.76g2.76g，巴比妥鈉，巴比妥鈉15.45g15.45g，用蒸餾水定容至，用蒸餾水定容至1000ml1000ml。 v2 2染色液：氨基黑染色液：氨基黑10b 0.25g10b 0.25g，用甲醇，用甲醇50ml50ml、冰醋、冰醋酸酸10ml10ml、水、水40ml40ml溶解（可重復(fù)使用）。溶解（可重復(fù)使用）。 v3 3漂洗液：甲醇或乙醇漂洗液：甲醇或乙醇45ml45ml，冰醋酸，冰醋酸5ml5ml，水，水50ml50ml，混勻?；靹颉?v4 4透明液（僅在定量分析時(shí)使用）：無水乙醇透明液（僅在定量分析時(shí)

9、使用）：無水乙醇7 7份，份，冰醋酸冰醋酸3 3份，混勻。份，混勻。 五、實(shí)驗(yàn)操作五、實(shí)驗(yàn)操作浸泡：將浸泡：將2 28 cm8 cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤面距短邊一端面距短邊一端1.5 cm1.5 cm處用鉛筆輕輕畫一條點(diǎn)樣線，將之置于盛有緩沖液處用鉛筆輕輕畫一條點(diǎn)樣線，將之置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡的平皿中，浸泡30 min30 min方可用于點(diǎn)樣方可用于點(diǎn)樣點(diǎn)樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然點(diǎn)樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）

10、。在另一后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一 載玻片上滴一滴血清，點(diǎn)載玻片上滴一滴血清，點(diǎn)樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動(dòng)一次），再將點(diǎn)樣樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動(dòng)一次），再將點(diǎn)樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線電泳槽的準(zhǔn)備：根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在電泳槽的準(zhǔn)備：根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個(gè)電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架，兩個(gè)電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架，各放兩層濾紙條，使濾紙一端

11、的長(zhǎng)邊與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電泳各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長(zhǎng)邊與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當(dāng)濾紙全部潤(rùn)濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以緩沖液中。當(dāng)濾紙全部潤(rùn)濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋電泳：將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝電泳：將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10 min10 min。通電，調(diào)節(jié)電壓至通電

12、，調(diào)節(jié)電壓至160 v160 v，電流強(qiáng)度為，電流強(qiáng)度為0.40.40.6 0.6 mama/cm/cm膜寬度，電泳時(shí)間膜寬度，電泳時(shí)間約約25 min25 min 染色：電泳完畢后將薄膜取下染色：電泳完畢后將薄膜取下, , 放在含氨基黑放在含氨基黑10b10b染色液的培養(yǎng)皿中浸染色液的培養(yǎng)皿中浸泡泡5 min5 min漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 臥式水平電泳槽臥式水平電泳槽 六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng)市售醋酸纖

13、維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在之一。若飄浮于液面的薄膜在151530 s30 s內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳一致，則此膜均勻可用于電泳醋酸纖維素薄膜電泳常選用醋酸纖維素薄膜電泳常選用ph8.6ph8.6巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.050.050.09 mol/l0.09 mol/l。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快區(qū)

14、帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分離效果離效果點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果電泳區(qū)帶分離效果電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度