分子生物學(xué)第二章DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制

1、核酸的結(jié)構(gòu)及其功能核酸的結(jié)構(gòu)及其功能 DNA-DNA-遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，基因是具有特定生遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，基因是具有特定生物功能的核苷酸序列，基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯物功能的核苷酸序列，基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯能夠使親代的性狀準(zhǔn)確地在子代表現(xiàn)出來。能夠使親代的性狀準(zhǔn)確地在子代表現(xiàn)出來。DNADNA的此種功能與其分子結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)。的此種功能與其分子結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)。 Erwin Chargaff用紙層析技術(shù)分析用紙層析技術(shù)分析DNA的核苷酸組分：的核苷酸組分：(1)腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即 A=T；(2)鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即 G

2、=C；(3)含氨基的腺嘌呤和胞嘧啶總數(shù)等于含酮基的鳥嘌呤和胸腺含氨基的腺嘌呤和胞嘧啶總數(shù)等于含酮基的鳥嘌呤和胸腺 嘧啶總數(shù)，即嘧啶總數(shù)，即 A+C=T+G；(4)嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即 A+G=C+T； 所有所有DNA中堿基組成必定是中堿基組成必定是A=T，G=C，這一規(guī)律暗示，這一規(guī)律暗示A與與T，C與與G相互配對(duì)的可能性，為相互配對(duì)的可能性，為Watson和和Crick提出提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)。雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)。 該模型揭示了該模型揭示了DNADNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基

3、配對(duì)原則，這是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是DNADNA復(fù)制、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。達(dá)的分子基礎(chǔ)。2.3 DNA的復(fù)制的復(fù)制 研究證明生命的遺傳實(shí)際上是染色體研究證明生命的遺傳實(shí)際上是染色體DNA自我復(fù)制的結(jié)自我復(fù)制的結(jié)果。而果。而DNA自我復(fù)制主要是通過半保留復(fù)制來實(shí)現(xiàn)的，是一自我復(fù)制主要是通過半保留復(fù)制來實(shí)現(xiàn)的，是一個(gè)以親代個(gè)以親代DNA分子為模板合成子代分子為模板合成子代DNA鏈的過程。即細(xì)胞鏈的過程。即細(xì)胞分裂時(shí)，通過分裂時(shí)，通過DNA自我復(fù)制將親代細(xì)胞所含有遺傳信息傳遞自我復(fù)制將親代細(xì)胞所含有遺傳信息傳遞

4、到子代細(xì)胞。到子代細(xì)胞。 雙鏈雙鏈DNA的復(fù)制包括的復(fù)制包括 復(fù)制的起始復(fù)制的起始、延伸延伸和和終止終止三個(gè)階段，三個(gè)階段，并需要拓?fù)洚悩?gòu)酶、解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、引物合成酶、并需要拓?fù)洚悩?gòu)酶、解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及聚合酶及DNA連接酶等酶和蛋白質(zhì)的參與。連接酶等酶和蛋白質(zhì)的參與。 Watson和和Crick提出提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的同時(shí)對(duì)其復(fù)制雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的同時(shí)對(duì)其復(fù)制過程進(jìn)行了探討。過程進(jìn)行了探討。 DNA在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷開，每條鏈分別作在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩

5、條鏈。 新合成新合成2條條DNA鏈的核苷酸序列和親代鏈的核苷酸序列和親代DNA鏈完全相同。鏈完全相同。因此，因此，每子代分子的一條鏈來自親代每子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合，另一條鏈則是新合成的，成的，DNA這種復(fù)制方式叫做這種復(fù)制方式叫做DNA的半保留復(fù)制。的半保留復(fù)制。氯化銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法： 由于由于15N-DNA分子的密度比普通分子的密度比普通DNA的密度大，在氯化銫密的密度大，在氯化銫密度梯度離心時(shí)，這兩種度梯度離心時(shí)，這兩種DNA分子形成位置不同的區(qū)帶。分子形成位置不同的區(qū)帶。結(jié)果證實(shí)：結(jié)果證實(shí)：無論原核還是真核生物無論原核還是真核生物DNAD

6、NA都是以半保留復(fù)制方式遺傳的都是以半保留復(fù)制方式遺傳的 DNA復(fù)制時(shí)，雙鏈復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，要解開成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，這個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉。這個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉。DNA的復(fù)的復(fù)制是由固定的起始位點(diǎn)開始的。制是由固定的起始位點(diǎn)開始的。 復(fù)復(fù) 制制 子子是生物體是生物體DNA復(fù)制的基本單位，一個(gè)復(fù)制子只含復(fù)制的基本單位，一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 復(fù)制叉復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開始沿著從復(fù)制起點(diǎn)開始沿著DNA鏈連續(xù)移動(dòng)，起始點(diǎn)可以鏈連續(xù)移動(dòng)，起始點(diǎn)可以啟動(dòng)單向復(fù)制或者雙向復(fù)制，這主要取決于在復(fù)制起點(diǎn)形成

7、一啟動(dòng)單向復(fù)制或者雙向復(fù)制，這主要取決于在復(fù)制起點(diǎn)形成一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。 1.富含富含AT：測(cè)定細(xì)菌、酵母、線粒體和葉綠體：測(cè)定細(xì)菌、酵母、線粒體和葉綠體DNA中的復(fù)中的復(fù)制起始點(diǎn)核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)復(fù)制起始點(diǎn)富含制起始點(diǎn)核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)復(fù)制起始點(diǎn)富含AT序列，它可序列，它可能有利于能有利于DNA復(fù)制啟動(dòng)時(shí)雙鏈的解開。復(fù)制啟動(dòng)時(shí)雙鏈的解開。 2. 細(xì)菌、病毒和線粒體細(xì)菌、病毒和線粒體DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，即分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，即只有一個(gè)復(fù)制子。只有一個(gè)復(fù)制子。 3. 真生物基因組真生物基因組DNA有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)

8、上進(jìn)行雙向復(fù)制，其大小為制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，其大小為40-100kb/個(gè)。個(gè)。 放射性自顯影法：對(duì)于大基因組內(nèi)的放射性自顯影法：對(duì)于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標(biāo)記復(fù)制的移動(dòng)。如果一個(gè)脈沖比用來標(biāo)記復(fù)制的移動(dòng)。如果一個(gè)脈沖比另一個(gè)脈沖強(qiáng)，我們可以用相對(duì)的標(biāo)記另一個(gè)脈沖強(qiáng)，我們可以用相對(duì)的標(biāo)記強(qiáng)度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。強(qiáng)度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復(fù)制：?jiǎn)蜗驈?fù)制：在復(fù)制眼的一端，一種類型在復(fù)制眼的一端，一種類型的標(biāo)記后緊跟著另一種標(biāo)記；的標(biāo)記后緊跟著另一種標(biāo)記；雙向復(fù)制：雙向復(fù)制：在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)生一種在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)

9、生一種（對(duì)稱的）模式。在真核生物中普遍存（對(duì)稱的）模式。在真核生物中普遍存在。在。 生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNA雙鏈的復(fù)制大都是以半保留方式雙鏈的復(fù)制大都是以半保留方式進(jìn)行的；但是不同生物進(jìn)行的；但是不同生物DNA分子存在形式各不相同，分子存在形式各不相同，如大小、線性分子、環(huán)狀分子、功能差異，因而反如大小、線性分子、環(huán)狀分子、功能差異，因而反映在復(fù)制方式上的差異。絕大多數(shù)映在復(fù)制方式上的差異。絕大多數(shù)DNA復(fù)制是以復(fù)復(fù)制是以復(fù)制叉的形式進(jìn)行的。制叉的形式進(jìn)行的。線性線性DNA雙鏈的復(fù)制雙鏈的復(fù)制 研究表明研究表明DNA聚合酶還是聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從聚合聚合酶都只從5端向端向3端移動(dòng)；體

10、內(nèi)端移動(dòng)；體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始引物起始DNA合合成，起始后成，起始后RNA引物被切除，使子鏈短于母鏈。切除后的引物被切除，使子鏈短于母鏈。切除后的5端缺口如何合成？這就提出了線性端缺口如何合成？這就提出了線性DNA末端復(fù)制的問題。末端復(fù)制的問題。壽命縮短？壽命縮短？線性線性DNA末端復(fù)制的特殊機(jī)制末端復(fù)制的特殊機(jī)制（1）線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子：）線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子：T4噬菌體噬菌體DNA通通過其末端的簡(jiǎn)并性使不同鏈的過其末端的簡(jiǎn)并性使不同鏈的3端因互補(bǔ)而結(jié)合。端因互補(bǔ)而結(jié)合。DNA聚合酶聚合酶作用填滿其缺口，再經(jīng)作用填滿其缺口，再經(jīng)DNA連接

11、酶作用生成二聯(lián)體。連接酶作用生成二聯(lián)體。（2）DNA末端形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，是該分子沒有游離的末端。末端形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，是該分子沒有游離的末端。如草履蟲線粒體如草履蟲線粒體DNA。（1）-復(fù)制復(fù)制（2）滾環(huán)復(fù)制）滾環(huán)復(fù)制（3）D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制2.2.環(huán)狀環(huán)狀DNADNA的復(fù)制的復(fù)制（1）-復(fù)制復(fù)制 E.coli基因組的復(fù)制原點(diǎn)位于天冬酰胺合酶和基因組的復(fù)制原點(diǎn)位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，合酶操縱子之間，全長(zhǎng)全長(zhǎng)=45 bp，稱為，稱為oriC。OriC富含富含AT，并含有多個(gè)短的重復(fù)序列，能夠，并含有多個(gè)短的重復(fù)序列，能夠被復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)合蛋白所識(shí)別。復(fù)制的起始：被復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)合蛋白所識(shí)

12、別。復(fù)制的起始： 涉及涉及DNA雙鏈的解旋和松雙鏈的解旋和松開，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈還是復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸開，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈還是復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短的序列被轉(zhuǎn)錄生成短的RNA鏈，作為起始鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。復(fù)制的引物。（2）滾環(huán)復(fù)制（）滾環(huán)復(fù)制（replication by rolling cycles structure） 這是單向復(fù)制的一種特殊形式。這是單向復(fù)制的一種特殊形式。X174噬菌體由一個(gè)單鏈環(huán)噬菌體由一個(gè)單鏈環(huán)狀狀DNA組成，這條鏈稱為正（組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)（）鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)（-）鏈

13、。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。(3)D-環(huán)型（環(huán)型（D-loop）：）： 這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即環(huán)（即D-環(huán)）。環(huán)）。 基因組基因組DNA是雙鏈環(huán)狀；復(fù)制起始區(qū)位于其遺傳圖的是雙鏈環(huán)狀；復(fù)制起始區(qū)位于其遺傳圖的84

14、min附近；附近；OriC含有含有3個(gè)個(gè)13bp和和4個(gè)個(gè)9bp的兩個(gè)保守序列。復(fù)制起始后形成的兩個(gè)復(fù)制叉沿著的兩個(gè)保守序列。復(fù)制起始后形成的兩個(gè)復(fù)制叉沿著整個(gè)基因組雙向等速移動(dòng)，整個(gè)基因組雙向等速移動(dòng)，DNA復(fù)制中間產(chǎn)物呈一個(gè)復(fù)制中間產(chǎn)物呈一個(gè)。 研究證實(shí)多種蛋白質(zhì)及酶參與研究證實(shí)多種蛋白質(zhì)及酶參與DNA雙鏈的解開過程。如拓雙鏈的解開過程。如拓?fù)洚悩?gòu)酶撲異構(gòu)酶I、DNA解鏈酶及解鏈酶及SSB蛋白等。蛋白等。 DNA helicase是經(jīng)水解是經(jīng)水解ATP獲得能量來解開雙鏈獲得能量來解開雙鏈DNA， 大大部分部分DNA helicase沿著隨后鏈模板沿著隨后鏈模板5 3方向及沿著復(fù)制叉的方向及

15、沿著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)。前進(jìn)而移動(dòng)。研究證明：研究證明：Rep蛋白和特定的蛋白和特定的DNA解鏈酶分別在解鏈酶分別在DNA兩條鏈兩條鏈上協(xié)調(diào)作用，以解開雙鏈上協(xié)調(diào)作用，以解開雙鏈DNA。 發(fā)現(xiàn)噬菌體發(fā)現(xiàn)噬菌體T4的的基因基因32蛋白蛋白可以在遠(yuǎn)低于解鏈溫度時(shí)使可以在遠(yuǎn)低于解鏈溫度時(shí)使雙鏈雙鏈DNA分開，并牢牢地結(jié)合在單鏈分開，并牢牢地結(jié)合在單鏈DNA上，后來發(fā)現(xiàn)許多上，后來發(fā)現(xiàn)許多生物中都有這類蛋白。生物中都有這類蛋白。 原核生物：原核生物：SSB蛋白與蛋白與DNA結(jié)合時(shí)還表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，如第結(jié)合時(shí)還表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，如第1個(gè)個(gè)SSB蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合DNA的能力為的能力為1，第，第2個(gè)個(gè)SSB蛋白的

16、結(jié)合力可蛋白的結(jié)合力可達(dá)達(dá)103。真核生物。真核生物SSB蛋白與單鏈蛋白與單鏈DNA結(jié)合時(shí)，不表現(xiàn)協(xié)同效結(jié)合時(shí)，不表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。應(yīng)。 SSB蛋白蛋白: 保證被解鏈酶解開的保證被解鏈酶解開的ssDNA在復(fù)制完成之前能在復(fù)制完成之前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，保持單鏈結(jié)構(gòu)，SSB蛋白以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，他蛋白以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，他沒有解鏈作用。沒有解鏈作用。 DNA復(fù)制過程中，隨著復(fù)制過程中，隨著DNA解旋，雙螺旋的盤繞數(shù)解旋，雙螺旋的盤繞數(shù)T減減少，而超螺旋數(shù)少，而超螺旋數(shù)W增加，使正超螺旋增加，未解鏈部分的纏增加，使正超螺旋增加，未解鏈部分的纏繞更加緊密，形成的壓力使解鏈不能繼續(xù)進(jìn)行。繞更

17、加緊密，形成的壓力使解鏈不能繼續(xù)進(jìn)行。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用拓?fù)洚悩?gòu)酶作用 它能夠消除解鏈造成的正超螺旋堆積，消除阻礙解鏈繼它能夠消除解鏈造成的正超螺旋堆積，消除阻礙解鏈繼續(xù)進(jìn)行的此種壓力，使續(xù)進(jìn)行的此種壓力，使DNA復(fù)制得以延伸。復(fù)制得以延伸。 研究發(fā)現(xiàn)：研究發(fā)現(xiàn)：所有所有DNA復(fù)制是由一個(gè)固定的起始位點(diǎn)開始；復(fù)制是由一個(gè)固定的起始位點(diǎn)開始；DNA聚合酶都只能延長(zhǎng)已存在的聚合酶都只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，而不能從頭鏈，而不能從頭合成合成DNA鏈。鏈。 問題：一個(gè)新鏈問題：一個(gè)新鏈DNA的復(fù)制怎樣開始的呢？的復(fù)制怎樣開始的呢？所有所有DNA聚合酶都從脫氧核苷酸聚合酶都從脫氧核苷酸3-OH端起始

18、端起始DNA合合成，所以，成，所以，DNA復(fù)制時(shí)，由引發(fā)酶復(fù)制時(shí)，由引發(fā)酶(特殊特殊RNA聚合酶聚合酶)在在DNA模模板上合成一段板上合成一段RNA鏈，它提供引發(fā)末端（引物），接著由鏈，它提供引發(fā)末端（引物），接著由DNA聚合酶從聚合酶從RNA引物的引物的3-OH端開始合成新的端開始合成新的DNA鏈。無論前導(dǎo)鏈鏈。無論前導(dǎo)鏈還是后隨鏈開始還是后隨鏈開始DNA合成時(shí)，都需要合成時(shí)，都需要RNA引物。引物。性性 dsDNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此在?fù)制叉附近的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此在?fù)制叉附近的DNA鏈一條是鏈一條是53，另一條是，另一條是3 5，即兩條模板極性不同。，即兩條模板極性不同。 而而

19、DNA聚合酶：聚合酶：DNA合成方向是合成方向是53，而不是，而不是3 5。 無法解釋無法解釋DNA兩條鏈?zhǔn)侨绾文軌蛲瑫r(shí)進(jìn)行復(fù)制？?jī)蓷l鏈?zhǔn)侨绾文軌蛲瑫r(shí)進(jìn)行復(fù)制？ 日本科學(xué)家日本科學(xué)家Okazaki通過含通過含3H-dTTP 培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸菌標(biāo)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸菌標(biāo)記其記其DNA，提出，提出DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型。的半不連續(xù)復(fù)制模型。 原核生物岡崎片段原核生物岡崎片段 真核生物岡崎片段真核生物岡崎片段 Okazaki fragment：10002000b。 岡崎片段與岡崎片段與DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型的半不連續(xù)復(fù)制模型前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制。 Tus

20、蛋白參與蛋白參與DNA復(fù)制的終止，而不需要太多蛋白質(zhì)的參復(fù)制的終止，而不需要太多蛋白質(zhì)的參與。終止子序列由與。終止子序列由22個(gè)堿基的重復(fù)序列的個(gè)堿基的重復(fù)序列的Ter組成。當(dāng)復(fù)制叉組成。當(dāng)復(fù)制叉遷移到遷移到Ter時(shí)，時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能使復(fù)合物能使DnaB不能再將不能再將DNA解鏈，解鏈，阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)遷移，而為復(fù)制的阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)遷移，而為復(fù)制的50-100bp經(jīng)修復(fù)方式填補(bǔ)。經(jīng)修復(fù)方式填補(bǔ)。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。5. DNA聚合酶聚合酶(1) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能聚合酶的種類及其功能Kl

21、enow 片段片段: This enzyme is purified from E. coli cells in which the 3- end two-thirds of the E. coli DNA polymerase I gene is cloned. Thus, it has 35exonuclease activity, but not 53exonuclease activity.68 kD35 kDDNA聚合酶聚合酶 其有其有53聚合酶活性，但活性低，其酶活性是聚合酶活性，但活性低，其酶活性是DNA聚合聚合酶酶的的5%。 通過其通過其3 5 核酸外切酶活性可起校正作用。核酸

22、外切酶活性可起校正作用。DNA聚合酶聚合酶 其有其有53聚合酶活性，聚合酶活性，3 5 核酸外切酶活性。該酶活核酸外切酶活性。該酶活性為性為DNA聚合酶聚合酶的的15倍，倍， DNA聚合酶聚合酶的的300倍。倍。即即5萬個(gè)核苷酸萬個(gè)核苷酸/min速度合成新速度合成新DNA鏈。鏈。其他其他DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶和和分別由分別由dinB和和umuD 2C基因編碼，主基因編碼，主要在要在SOS修復(fù)過程中發(fā)揮作用。修復(fù)過程中發(fā)揮作用。 2.4.2 真核生物真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制的特點(diǎn) （1）DNA分子上出現(xiàn)多復(fù)制起始位點(diǎn)；分子上出現(xiàn)多復(fù)制起始位點(diǎn)； （2）真核生物染色體在全部完成

23、復(fù)制前，各個(gè)起始點(diǎn)上）真核生物染色體在全部完成復(fù)制前，各個(gè)起始點(diǎn)上 DNA復(fù)制不能再開始；復(fù)制不能再開始； （3）真核生物）真核生物DNA復(fù)制只在其細(xì)胞周期復(fù)制只在其細(xì)胞周期S期進(jìn)行；期進(jìn)行； （4）真核生物復(fù)制子大小約為）真核生物復(fù)制子大小約為40100kb。真核生物真核生物DNA復(fù)合起始區(qū)特點(diǎn)：復(fù)合起始區(qū)特點(diǎn)： 酵母復(fù)制起始區(qū)長(zhǎng)度約為酵母復(fù)制起始區(qū)長(zhǎng)度約為150bp，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必須，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必須的保守區(qū)，的保守區(qū)， 將克隆該將克隆該DNA片段構(gòu)建環(huán)狀片段構(gòu)建環(huán)狀DNA分子，它在酵分子，它在酵母中自主復(fù)制的。母中自主復(fù)制的。 酵母復(fù)制起始位點(diǎn)成為酵母復(fù)制起始位點(diǎn)成為自主復(fù)制序列

24、自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequences, ARS）。不同）。不同ARS共同特征是具有一個(gè)共同特征是具有一個(gè)11個(gè)個(gè)A-T堿基對(duì)的保守序列。堿基對(duì)的保守序列。 ORC（origin recognition complex）識(shí)別并結(jié)合）識(shí)別并結(jié)合ARS序列，序列，ORC有有6種蛋白組成的起動(dòng)復(fù)合物。種蛋白組成的起動(dòng)復(fù)合物。 人類基因組人類基因組DNA上每隔上每隔30000300 000bp序列有一個(gè)復(fù)制序列有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。真核生物起始位點(diǎn)。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度為復(fù)制叉的移動(dòng)速度為50bp/sec，E.coli的的1/20。真核生物真核生物D

25、NA聚合酶聚合酶 哺乳動(dòng)物主要有哺乳動(dòng)物主要有5種種DNA聚合酶，其特性見表聚合酶，其特性見表2-12.v原核細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長(zhǎng)增殖原核細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長(zhǎng)增殖速度不同的細(xì)胞中速度不同的細(xì)胞中DNA鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)量不同。制叉的數(shù)量不同。 v細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和RNA。v大腸桿菌染色體大腸

26、桿菌染色體DNA復(fù)制調(diào)控復(fù)制調(diào)控 染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細(xì)胞分裂染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細(xì)胞分裂不直接耦聯(lián)。復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，而復(fù)制的終止則不直接耦聯(lián)。復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，而復(fù)制的終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。能引發(fā)細(xì)胞分裂。 v復(fù)制子與轉(zhuǎn)錄的操縱子相似，由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部復(fù)制子與轉(zhuǎn)錄的操縱子相似，由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部分組成。起始物位點(diǎn)編碼復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，復(fù)制起點(diǎn)與調(diào)節(jié)分組成。起始物位點(diǎn)編碼復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，復(fù)制起點(diǎn)與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用并啟動(dòng)復(fù)制。起始物位點(diǎn)突變使復(fù)制停止并蛋白質(zhì)相互作用并啟動(dòng)復(fù)制。起始物位點(diǎn)突變使復(fù)制停止并導(dǎo)致細(xì)胞死

27、亡。導(dǎo)致細(xì)胞死亡。v大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)有OriC和和OriH兩種，其中兩種，其中OriC是首選是首選的復(fù)制起點(diǎn)，而的復(fù)制起點(diǎn)，而OriH是在是在RNaseH缺失突變株中發(fā)現(xiàn)的一系缺失突變株中發(fā)現(xiàn)的一系列復(fù)制起點(diǎn)。列復(fù)制起點(diǎn)。 調(diào)控主要表現(xiàn)在復(fù)制的起始水平上調(diào)控主要表現(xiàn)在復(fù)制的起始水平上E.coli 細(xì)胞分裂周期細(xì)胞分裂周期 依營(yíng)養(yǎng)條件變化依營(yíng)養(yǎng)條件變化 DNA復(fù)制周期基本保持復(fù)制周期基本保持30-40min/cycle 37 葡萄糖（葡萄糖（C源）源） 45 min/cell cycle 琥珀酸（琥珀酸（C源）源） 70 min/cell cycle C starved 1

28、0 hrs/cell cycle C suffice 21 min/cell cycle But DNA replication 40min more or less by premature initiation ColE1質(zhì)粒：質(zhì)粒：6646 bp的小質(zhì)粒的小質(zhì)粒 拷拷 貝貝 數(shù)：數(shù)：2030/cell ColE1質(zhì)粒：不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿質(zhì)粒：不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿 主主DNA聚合酶聚合酶I 質(zhì)粒編碼：兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子質(zhì)粒編碼：兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白和反義蛋白和反義RNA（RNA1），），Rop蛋白和蛋白和RNA1控制控制DNA合成所需的引物。合成所

29、需的引物。 RNA1通過與引物通過與引物RNA前體互補(bǔ)作用，阻止前體互補(bǔ)作用，阻止RNaseH加工引物前體，加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物，而對(duì)使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物，而對(duì)DNA復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。 Rop蛋白能提高蛋白能提高RNA1與引物前體的互補(bǔ)，增強(qiáng)了與引物前體的互補(bǔ)，增強(qiáng)了RNA1的負(fù)調(diào)控的負(fù)調(diào)控作用。作用。primer（555nts） v真核細(xì)胞的生活周期包括真核細(xì)胞的生活周期包括G1、S、G2和和M等等4個(gè)期。個(gè)期。vG1:復(fù)制預(yù)備期，復(fù)制預(yù)備期，S:復(fù)制期，復(fù)制期，G2:有絲分裂準(zhǔn)備期，有絲分裂準(zhǔn)備期，M:有絲分有絲分裂期。裂期。vDNA復(fù)制只發(fā)生在

30、復(fù)制只發(fā)生在S期。期。v真核生物真核生物DNA復(fù)制有復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控：個(gè)水平的調(diào)控：(1)細(xì)胞生活周期水平調(diào)控細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 決定細(xì)胞停留在決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入期還是進(jìn)入S期。許多外部因素和細(xì)胞期。許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制調(diào)控。因子參與限制調(diào)控。 如促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可以誘導(dǎo)細(xì)胞由如促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可以誘導(dǎo)細(xì)胞由G1期進(jìn)入期進(jìn)入S期。期。(2)染色體水平調(diào)控染色體水平調(diào)控 決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在定順序在S期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制機(jī)制還不清楚？期起始復(fù)制，這種有

31、序復(fù)制機(jī)制還不清楚？（3）復(fù)制子水平調(diào)控）復(fù)制子水平調(diào)控 決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。生物是高度保守的。 此外，真核生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄活化、復(fù)制起始此外，真核生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄活化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段。許多參與復(fù)制起始蛋白復(fù)合物的合成和引物合成等階段。許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類似的功能與原核生物中相類似 2.5 DNA的修復(fù)的修復(fù) 一個(gè)物種能夠一代一代地遺傳下去，是因?yàn)橐粋€(gè)物種能夠一代一代地遺傳下去，是因?yàn)镈NA能夠穩(wěn)定復(fù)能夠穩(wěn)定復(fù)制。如果制。如果DNA不能穩(wěn)定地復(fù)制，那么，物種就不存在了。但，不能穩(wěn)定地復(fù)制，那么，物種就不存在了。但，在進(jìn)化過程中，受到各種因素的影響，導(dǎo)致在進(jìn)化過程中，受到各種因素的影響，導(dǎo)致DNA復(fù)制的差錯(cuò)或復(fù)制的差錯(cuò)或堿基突變，使生物具有多