移植受者免疫抑制治療影響外周血微量CMVDNA的變化

1、移植受者免疫抑制治療影響外周血微量CMV DNA的變化【摘要】 目的:探討移植術(shù)后免疫抑制治療個(gè)體,外周血中巨細(xì)胞病毒脫氧核糖核酸（CMV DNA）的變化規(guī)律，并評(píng)價(jià)其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法:通過對(duì)免疫抑制治療個(gè)體、健康個(gè)體外周血微量CMV DNA的檢測(cè)，分析CMV DNA與免疫抑制劑濃度的關(guān)系；同時(shí)對(duì)30例患者的連續(xù)標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)，說明過度免疫抑制可導(dǎo)致微量CMV DNA的出現(xiàn)。結(jié)果:健康個(gè)體組、環(huán)孢素組、FK506組中微量CMV DNA陽(yáng)性率分別達(dá)到0%、42.24%和11.8%，陽(yáng)性組平均免疫抑制藥物濃度明顯高于陰性組（P<0.05），高藥物濃度組陽(yáng)性率明顯高于低濃度組

2、（P<0.05）。配對(duì)實(shí)驗(yàn)提供了相同的結(jié)果。結(jié)論:免疫抑制藥物濃度影響微量CMV DNA動(dòng)態(tài)的變化，部分反映了個(gè)體免疫抑制狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有一定的價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】 移植 免疫抑制 巨細(xì)胞病毒 Abstract: Objective:To investigate approved immunosupression concentration whether influence trace CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells of the posttransplantion. Methods: 294 cases of p

3、atients (410 cases of blood sample) of post-transplantation and 96 cases samples of health check up were collected continuously in 2 months. Immunosuppression concentration and CMV DNA were measured with TDx，IMX and nested PCR respectively. Immunosuppression concentration of patients whose samples w

4、ere continuously detected CMV DNA positive and negative were analyzed by paired samples test. Result: CMV DNA was detected in 42.24% and 11.8% in CSA or FK506 treated patients but not in all 96 health check up individuals. As CSA concentration up to 200ng/ml, patients had highest CMV DNA positive ra

5、te 55.71% (P<0.05）. The mean CSA and FK506 concentrations of CMV DNA positive group were higher than that of CMV DNA negative group (P<0.05）;paired samples test get the more significant result （P<0.05）. Conclusion: Nested PCR detected CMV DNA maybe an assay for indirectly evalua

6、ted immunosupression state of the posttransplantation. Key words: transplantation；immunosuppression；CMV 排斥或感染一直是移植受者服用免疫抑制藥物必須面臨的兩大問題。而解決此矛盾的首要措施即是尋找一個(gè)能綜合反映個(gè)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)，建立評(píng)價(jià)個(gè)體免疫抑制狀態(tài)的有效技術(shù)。國(guó)人抗CMV IgG陽(yáng)性率接近100%，世界范圍內(nèi)亦有60%100%的感染率。根據(jù)CMV的潛伏感染特點(diǎn)，嘗試以外周血微量CMV DNA作為評(píng)價(jià)免疫抑制狀態(tài)的指標(biāo)，采用敏感的巢式聚合酶鏈反應(yīng)（nPCR）技術(shù)檢測(cè)移植受者外周血中微量CM

7、V DNA，并探討其與免疫抑制程度的關(guān)系。 1 材料和方法 1.1 免疫抑制藥物濃度檢測(cè) 受者的免疫抑制方案均以環(huán)孢素（CSA）或他克莫司（FK506）為主。服藥前，抽取靜脈血測(cè)全血CSA或FK506濃度谷值。CSA、FK506濃度分別采用酶免疫發(fā)光技術(shù)（儀器Abbott TDx）和微粒子酶免疫分析技術(shù)（儀器Abbott IMx）測(cè)定。 1.2 標(biāo)本及分組 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)受者及96例健康體檢人員的血漿CMV IgG抗體，并檢測(cè)CMV DNA。連續(xù)收集2006年10月至2006年12月移植隨訪者藥物濃度檢測(cè)血標(biāo)本，共294例受者，410例次。移植隨訪者均為移植術(shù)后3個(gè)月以上。其中服用C

8、SA為173人，服用FK506為121人；男180例，女114例，平均年齡（44.39±11.97）歲。根據(jù)免疫藥物濃度（CSA以200 ng/ml或120 ng/ml為界線；而FK506濃度以5 ng/ml為界線）將其分組。另根據(jù)CMV DNA檢測(cè)結(jié)果將其分為陽(yáng)性組和陰性組。其中46例多次檢測(cè)，當(dāng)同一個(gè)體先后出現(xiàn)CMV DNA陽(yáng)性和陰性時(shí)對(duì)其藥物濃度進(jìn)行配對(duì)比較（此兩標(biāo)本為連續(xù)收集的標(biāo)本）。移植患者術(shù)前行常規(guī)CMV DNA檢查，結(jié)果均提示陰性。移植患者術(shù)后第3周開始予更昔絡(luò)維針250 mg/d預(yù)防病毒感染治療，療程1周。 1.3 DNA提取 收集環(huán)孢素濃度測(cè)定標(biāo)本，取300l全血加

9、入0.98%的NH4Cl 1ml破紅細(xì)胞膜10 min，離心后取白細(xì)胞加入300l細(xì)胞裂解液，充分混勻后放置10 min；加入蛋白質(zhì)沉淀液150l充分混勻，離心5 min(12 000 r/min)；取上清液加入異丙醇300l沉淀蛋白質(zhì)；以75%乙醇洗3次，待乙醇蒸發(fā)后加入溶解液100l，-20 保存。 1.4 核酸擴(kuò)增 nPCR:根據(jù)CMV病毒基因組設(shè)計(jì)引物,第一次PCR擴(kuò)增引物分別為P1 5'-TCTAAGAC ATAGCAGCACAGCACC-3'和P2 5'-TGAAAAAATATACCCAGAC GGAAG-3'；第二次PCR擴(kuò)增引物分別為P3 5&#

10、39;-AGCAC CCGACAGAACTCACT-3'和P4 5'-TATGGCTTATGCCCAGAAAA-3'。取1l DNA用于10l的 PCR體系，其中包括：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTP、0.45 U Taq polymerase、0.1M引物和5%甘油。第一次PCR條件為94 2 min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94 20 s，58 60 s，72 60 s；最后進(jìn)行72 2 min延伸。完成后取1l PCR產(chǎn)物用于第二次擴(kuò)增，94 2 min后，進(jìn)行25

11、個(gè)循環(huán)，94 10 s，55 30 s，72 30 s；最后進(jìn)行72 2 min延伸。經(jīng)2%的瓊脂糖電泳，紫外分析儀上觀察結(jié)果。標(biāo)本分別檢測(cè)3次，出現(xiàn)一次陽(yáng)性便判斷為陽(yáng)性。常規(guī)PCR:反應(yīng)條件同上，循環(huán)次數(shù)增加到35次，引物分別采用P3、P4。 1.5 臨床觀察 對(duì)所有具CMV發(fā)病癥狀的受者進(jìn)行常規(guī)pp65檢測(cè)。通過核對(duì)pp65記錄，回顧性分析CMV DNA陽(yáng)性受者是否出現(xiàn)CMV發(fā)病的典型癥狀。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 對(duì)CMV DNA陽(yáng)性、陰性兩組環(huán)孢素、FK506濃度進(jìn)行student T test分析。采用卡方檢驗(yàn)分析不同免疫抑制藥物濃度組CMV DNA陽(yáng)性率的差別。配對(duì)兩組進(jìn)行非參數(shù)M

12、ann Whitney檢驗(yàn)。 2 結(jié)果 2.1 CMV DNA陽(yáng)性受者平均免疫抑制藥物濃度高于陰性受者 所有受者和96例健康體檢者CMV IgG均為陽(yáng)性。232例次標(biāo)本的平均環(huán)孢素濃度為（165.42±89.90）ng/ml，CMV DNA nPCR檢出率為42.24%（98/232），常規(guī)PCR未能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果（0%）；96例健康體檢個(gè)體采用nPCR未檢測(cè)到CMV DNA。CMV DNA陽(yáng)性組環(huán)孢素濃度明顯高于CMV DNA陰性組，兩者差異有顯著性（見表1）。在服用FK506的患者中亦有相同結(jié)果（7.943±4.22）ng/ml vs（6.314±3.92）n

13、g/ml；P=0.025，其中10例患者前后配對(duì)實(shí)驗(yàn)亦顯示有相近的結(jié)果（P0.05）。 2.2 高藥物濃度組CMV DNA陽(yáng)性率增加 同樣，以6 ng/ml為界FK506高濃度組微量CMV DNA陽(yáng)性率明顯高于低FK506濃度組（P0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.3 CMV DNA陽(yáng)性結(jié)果并非CMV發(fā)病 所有受者中8例出現(xiàn)臨床類似癥狀，懷疑CMV感染需要檢測(cè)pp65抗原，但結(jié)果均為陰性，不能診斷為CMV抗原血癥或CMV發(fā)病。8例患者中兩例受者可檢測(cè)到微量CMV DNA。 3 討論 CSA、FK506是從土壤真菌中提取的抗生素，具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，是移植后免疫抑制治療方案的主要成分。但是過度

14、的免疫抑制會(huì)造成嚴(yán)重的不良后果，其中，感染是移植術(shù)后受者死亡的主要原因，了解免疫抑制治療是否應(yīng)用過度是預(yù)防發(fā)生感染的重要手段。臨床觀察發(fā)現(xiàn)外周血中高濃度的免疫抑制藥物可導(dǎo)致多種感染的發(fā)生，由于缺乏免疫抑制狀態(tài)的評(píng)價(jià)指標(biāo)而僅能通過臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行治療，如術(shù)后1個(gè)月內(nèi)服用更昔洛韋和磺胺類藥物預(yù)防感染發(fā)生。 CMV是免疫抑制受者最易感染的病原體之一。主要原因是CMV在初次感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，還可在體內(nèi)潛伏感染。在這種潛伏感染狀態(tài)下，采用nPCR方法檢查，健康個(gè)體外周血中極少出現(xiàn)微量CMV DNA（0.2%）1，2。個(gè)體免疫狀態(tài)是決定CMV發(fā)病的主要因素，孕婦、新生兒、艾滋病患者、腫瘤患者和免疫抑制劑使用

15、者發(fā)病幾率明顯高于正常個(gè)體3。目前普遍采用抗pp65蛋白抗體標(biāo)記外周血白細(xì)胞，呈陽(yáng)性者可診斷為CMV抗原血癥提示CMV發(fā)病，或通過熒光定量PCR檢測(cè)CMV DNA診斷CMV病3。nPCR比傳統(tǒng)PCR具有更高的靈敏度，其檢測(cè)范圍亦高于熒光定量PCR技術(shù)，但是其陽(yáng)性結(jié)果并不提示發(fā)生CMV病。 目前為止，尚未建立評(píng)價(jià)個(gè)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)或系統(tǒng)。如果以體內(nèi)潛伏的病毒作為靶目標(biāo)，檢測(cè)此微量病毒可能對(duì)評(píng)估整體免疫是一個(gè)有效手段。nPCR可檢測(cè)到極微量CMV DNA，我們發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后接受免疫抑制治療的受者中42.24%在其外周血中可檢測(cè)到CMV DNA，而96例健康體檢的個(gè)體無(wú)一例呈陽(yáng)性結(jié)果。就潛伏感染個(gè)體而

16、言，隨著免疫抑制藥物濃度上升必然發(fā)生CMV病4，移植最初的3個(gè)月內(nèi)血CSA谷濃度可超過200 ng/ml，是需要抗病毒預(yù)防治療的階段。nPCR證實(shí)當(dāng)免疫抑制達(dá)到此水平時(shí)可使55.71%的患者體內(nèi)潛伏CMV激活并可檢測(cè)到微量CMV DNA。如果未見明顯癥狀，這時(shí)機(jī)體的免疫狀態(tài)同CMV達(dá)到一個(gè)平衡，即受者不能完全清除CMV又不發(fā)病。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)免疫抑制藥物濃度升高時(shí)CMV DNA陽(yáng)性率亦增加，可出現(xiàn)伴隨藥物濃度的升降而出現(xiàn)CMV DNA陽(yáng)性、陰性的動(dòng)態(tài)變化可以認(rèn)為微量CMV DNA間接反映了免疫抑制程度。但是并非所有使用免疫抑制受者都會(huì)出現(xiàn)微量CMV DNA，微量CMV DNA陰性的個(gè)體CSA濃度處

17、于相對(duì)較低水平，這部分受者在本實(shí)驗(yàn)期間亦未出現(xiàn)急性排斥癥狀，證實(shí)有效的免疫抑制可以同時(shí)避免排斥發(fā)生和CMV激活。但在環(huán)孢素濃度小于120 ng/ml組中尚有32.9%的患者有微量CMV DNA存在，可能提示其個(gè)體因素（如對(duì)免疫抑制藥物敏感）或與其他免疫抑制劑聯(lián)合用藥而存在過度免疫抑制。由于缺乏評(píng)價(jià)個(gè)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)或系統(tǒng)，此實(shí)驗(yàn)只能結(jié)合藥物濃度和微量CMV DNA的出現(xiàn)來解釋免疫抑制狀態(tài)。 免疫抑制程度決定了排斥或感染的發(fā)生，如何做到恰如其分地進(jìn)行個(gè)體化治療一直是臨床討論的話題。相同范圍的免疫抑制藥物濃度，對(duì)不同個(gè)體產(chǎn)生的免疫抑制程度和毒性也不相同，臨床治療須體現(xiàn)出個(gè)體化，但評(píng)價(jià)個(gè)體的免疫抑制

18、程度、免疫狀態(tài)的方法和標(biāo)準(zhǔn)并未確定5，6。用微量CMV DNA評(píng)價(jià)服用FK506患者的免疫抑制程度，并未表現(xiàn)出同CSA組一樣大的差別，但兩者都顯示了相同的趨勢(shì)。故我們認(rèn)為以體內(nèi)潛伏的CMV激活作為反映機(jī)體免疫抑制程度的指標(biāo)，結(jié)合敏感的nPCR技術(shù)，可能是反映機(jī)體免疫抑制程度的有效方法。那么能否對(duì)狀態(tài)穩(wěn)定的受者根據(jù)微量CMV DNA情況并結(jié)合臨床調(diào)整免疫抑制劑的用藥呢，這確實(shí)還需要大量的臨床實(shí)踐及進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室和臨床證據(jù)才能確定。【參考文獻(xiàn)】 1 Roback JD, Drew WL, Laycock ME,et al. CMV DNA is rarely detected in healthy

19、 blood donors using validated PCR assaysJ. Transfusion, 2003, 43(3):314-321.2 Greenlee DJ, Fan H, Lawless K, et al. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC unitsJ. Transfusion, 2002, 42(4):403-408.3 Navalpotro D, Gimeno C, Navarro D. PCR detection of viral DNA in serum as an ancillary analysis for the diagnosis