微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的研究

1、微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生成微生物法轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的研究香草醛的研究研究生：趙麗青研究生：趙麗青導導 師：孫志浩師：孫志浩2005.10.282005.10.28研究報告研究報告vzhao li-qing, sun zhi-hao, zheng pu, zhu lei-lei. biotransformation of isoeugenol to vanillin by a novel strain, bacillus fusiformis. biotechnology letters. 2005, 27: 15051509 香香 草草 醛醛別名：香蘭素、香草素、香蘭醛，別名：香蘭素、香草

2、素、香蘭醛，香茅醛，香茅醛，3-3-甲基原兒茶醛甲基原兒茶醛 最重要的香味物質(zhì)之一，廣泛應最重要的香味物質(zhì)之一，廣泛應用于食品、飲料、香料、醫(yī)藥等用于食品、飲料、香料、醫(yī)藥等各領(lǐng)域各領(lǐng)域 市場來源：天然香草醛市場來源：天然香草醛 合成香草醛合成香草醛 合成香草醛合成香草醛丁香精半合成法丁香精半合成法松柏苷水解法松柏苷水解法丁香酚丁香酚法法黃樟素法黃樟素法愈創(chuàng)木酚法愈創(chuàng)木酚法對羥基苯甲醛法對羥基苯甲醛法木質(zhì)素法木質(zhì)素法對甲酚法對甲酚法鄰苯二酚法鄰苯二酚法電解合成法電解合成法v最常見：最常見：v愈創(chuàng)木酚法愈創(chuàng)木酚法v木質(zhì)素法木質(zhì)素法v年產(chǎn)：年產(chǎn)：10 000 tv市場價格市場價格 us$ 11 k

3、g-1 天然香草醛天然香草醛香莢蘭豆提取法香莢蘭豆提取法主要生產(chǎn)地：馬達加斯加、科摩洛島、塔希提主要生產(chǎn)地：馬達加斯加、科摩洛島、塔希提島、墨西哥、印度尼西亞、留尼旺、塞古爾、島、墨西哥、印度尼西亞、留尼旺、塞古爾、毛里求斯毛里求斯我國：云南、海南我國：云南、海南年產(chǎn)：年產(chǎn)：20 t；約；約 us$ 3 000 kg-1 植物細胞培養(yǎng)法植物細胞培養(yǎng)法未見商業(yè)化生產(chǎn)報道未見商業(yè)化生產(chǎn)報道 生物轉(zhuǎn)化法生物轉(zhuǎn)化法生物香蘭素生物香蘭素指利用真菌、細菌、植物細胞、酶或基因工程指利用真菌、細菌、植物細胞、酶或基因工程菌生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)素、丁子香酚、異丁子香酚等菌生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)素、丁子香酚、異丁子香酚等天然化合物

4、前體物，生物合成的香草醛天然化合物前體物，生物合成的香草醛 隨著消費者對健康的關(guān)注及美國和歐盟的規(guī)定，隨著消費者對健康的關(guān)注及美國和歐盟的規(guī)定，天然香蘭素的市場需求日益增長天然香蘭素的市場需求日益增長生物香蘭素是最佳的天然提取香蘭素的替代品生物香蘭素是最佳的天然提取香蘭素的替代品其其在生產(chǎn)規(guī)模上一旦形成優(yōu)勢可取代人工合成在生產(chǎn)規(guī)模上一旦形成優(yōu)勢可取代人工合成的香草醛的香草醛 生物技術(shù)法生物技術(shù)法前體物質(zhì)：木質(zhì)素、丁香酚、異丁香酚、前體物質(zhì)：木質(zhì)素、丁香酚、異丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等族氨基酸等阿魏酸兩步法阿魏酸兩步法（商業(yè)化，（商

5、業(yè)化， us$ 600 kg-1 ）主要問題：底物價格較高，生成產(chǎn)物過程主要問題：底物價格較高，生成產(chǎn)物過程復雜，副產(chǎn)物較多復雜，副產(chǎn)物較多 丁香酚丁香酚/異丁香酚法異丁香酚法異丁香酚異丁香酚 och3ohch=ch-ch3 丁香酚丁香酚 ch2ch=ch2 och3 oh 酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法1990年年，yoshimoto 等人等人，分離出一種苯乙烯雙氧分離出一種苯乙烯雙氧酶酶，并從相應的苯乙烯和異丁香酚轉(zhuǎn)化生成香草醛并從相應的苯乙烯和異丁香酚轉(zhuǎn)化生成香草醛1993年，年，markus提出用脂氧合酶以異丁香酚和丁香提出用脂氧合酶以異丁香酚和丁香酚為底物酶法制備香草醛酚為底物酶法制備香草醛199

6、4年，年，mane和和zucca用脂氧化合酶從丁香酚、異用脂氧化合酶從丁香酚、異丁香酚或松柏醇制備香草醛并得到最高濃度達丁香酚或松柏醇制備香草醛并得到最高濃度達22.8 g l-1的香草醛的香草醛酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法主要問題主要問題易受季節(jié)及大豆來源、批次等的影響，生易受季節(jié)及大豆來源、批次等的影響，生產(chǎn)及研究不夠穩(wěn)定產(chǎn)及研究不夠穩(wěn)定 微生物轉(zhuǎn)化法微生物轉(zhuǎn)化法香草醛濃度普遍偏低香草醛濃度普遍偏低further transferredreasonsproduct inhibitionsubstrate inhibitionvanillinvanillic acid微生物菌株的篩選微生物菌株的篩選 土

7、樣 增殖培養(yǎng) 以異丁香酚為唯一碳源的選擇性平板培養(yǎng) 挑選不同培養(yǎng)特征的菌落至斜面 初篩 復篩， 香草醛降解實驗 菌株純化分離 香 草 醛 產(chǎn) 生 菌（出發(fā)菌株） 各菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛能力各菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛能力 v反應液反應液（g/l） 異丁香酚異丁香酚 20 k2hpo4 3h2o 14 kh2po4 5.2v ph 7.0，28， 180 r/min，3 d hplc測定測定各菌株降解香草醛能力各菌株降解香草醛能力 v反應液（反應液（g/l） 香草醛香草醛 2 k2hpo4 3h2o 14 kh2po4 5.2vph 7.0 ，28，180 r/min，3 d 反應液總組分

8、反應液總組分gc-ms圖譜圖譜relative abundance o h och3 cho och3 oh ch=ch-ch3 rt/mincompoundsarea %16.09isoeugenol11.6016.92isoeugenol56.9118.83vanillin13.82sw-b9 sw-b9 在異丁香酚存在時的生長情況在異丁香酚存在時的生長情況sw-b9sw-b9對香草醛的降解情況對香草醛的降解情況菌種鑒定菌種鑒定v生理生化鑒定生理生化鑒定v16s rrna序列分析序列分析 形態(tài)觀察形態(tài)觀察v 前期細胞前期細胞 產(chǎn)芽孢細胞產(chǎn)芽孢細胞 成熟芽孢成熟芽孢 tem照片照片 1 m1

9、 m 細胞與周身鞭毛細胞與周身鞭毛 細胞及端生芽孢細胞及端生芽孢 16s rrna序列分析序列分析提取細胞總提取細胞總dnapcr擴增擴增 p1 (5agagtttgatcctggctcag3) p2 (5aaggaggtgatccagccgca3) 獲得獲得1525 個堿基對個堿基對pcr產(chǎn)物直接測序（寶生物工程（大連）有限產(chǎn)物直接測序（寶生物工程（大連）有限公司）公司）該序列與該序列與genbank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析 sw-b9及其從及其從genbank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬種構(gòu)建的系統(tǒng)樹屬種構(gòu)建的系統(tǒng)樹 0.02 filibacter limicola

10、dsm 13886t (aj292316) bacillus macroides lmg 18474 (aj628749) bacillus silvestris hr3-23 (aj006086) bacillus sphaericus b3 (aj311893) sw-b9 bacillus fusiformis dsm 2898t (aj310083) caryophanon tenue dsm 14151 (aj491302) caryophanon latum dsm 14152 (aj491303) 100 88 98 100 100 兩相轉(zhuǎn)化體系的建立兩相轉(zhuǎn)化體系的建立菌株菌株sw-b9sw-b9在兩相體系與單相體系下在兩相體系與單相體系下的轉(zhuǎn)化能力對比的轉(zhuǎn)化能力對比主要結(jié)論主要結(jié)論v從土壤中篩選獲得了性能優(yōu)異的菌株從土壤中篩選獲得了性能優(yōu)