EMT的研究進展和具體信息

1、上皮細胞間質細胞轉換機制上皮細胞獲得干細胞表型或惡性變的途徑上皮細胞-間質細胞轉換在胚胎發(fā)育過程中具有十分重要的地位?，F(xiàn)在，越來越多的數(shù)據表明該過程在調控正常人體組織和腫瘤組織的細胞可塑性（cellular plasticity）方面也起到了關鍵作用。通過上皮細胞間質細胞轉換過程能夠形成多個各不相同的細胞亞群，即形成了腫瘤細胞異質性（intratumoural heterogeneity）。這些亞群細胞都具有各自的特點，有一些可能分化程度較高，但還有一些則表現(xiàn)出了干細胞的特征。而這些特征又都與腫瘤相關表型，比如腫瘤轉移或致死率等有關，因此，如何針對腫瘤細胞的這種干細胞特征（即可塑性）來設計治療

2、方案、尋找治療藥物已經成為了臨床研究中的一大熱點。雖然還有很多問題需要我們去解決，但這的確是一個非常有希望的發(fā)展方向。細胞從上皮細胞表型轉變成間質細胞表型的過程被稱作上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）而相反的轉變過程則稱為間質-上皮轉換（mesenchymal-epithelial transitions，MET），這些轉變過程在胚胎發(fā)育（embryonic development）過程中都起到了關鍵性的作用，不過最近科研人員們又發(fā)現(xiàn)他們在腫瘤形成及致病過程中也起到了至關重要的作用。EMT過程是一個非常復雜的分子過程，上皮可以通過EM

3、T過程“褪去”已分化細胞的特性，比如細胞間的粘附（cellcell adhesion）現(xiàn)象、細胞極性（polarity）現(xiàn)象、細胞缺乏運動能力等等這些表型，獲得間質細胞的特征，比如細胞具備移動能力（motility）、侵襲能力（invasiveness）、抗凋亡（resistance to apoptosis）能力等。EMT轉分化過程（transdifferentiation）最開始是在細胞培養(yǎng)過程中被發(fā)現(xiàn)的，不過一直以來學界對該過程與體內生理過程之間的關系還存在爭議。隨著科研工作者們對人體腫瘤和實驗動物模型的觀察越來越深入，他們逐漸發(fā)現(xiàn)EMT過程不僅與正常的胚胎發(fā)育過程有關，還與腫瘤發(fā)生過程

4、有關。因此，與對胚胎發(fā)育過程（詳見背景知識框1）的作用相類似，EMT過程和MET過程似乎也都參與了腫瘤發(fā)生的過程。尤其是EMT過程對于腫瘤浸潤（invasion）、轉移播散（metastatic dissemination）以及對藥物或治療的抗性等性狀都有關系，而與EMT過程相對的MET過程則似乎是在腫瘤細胞播散之后形成轉移灶的過程當中發(fā)揮作用。胚胎發(fā)育與腫瘤形成之間有一個本質的區(qū)別，那就是腫瘤形成過程中基因異常的細胞會逐漸失去對正常生長調控信號的反應性，獲得了進化的能力。這種進化現(xiàn)象是因為大部分贅生性細胞（neoplastic cell）所固有的遺傳和表型因子不穩(wěn)定性所造成的。這種不穩(wěn)定性還

5、能在腫瘤組織中形成多個細胞亞群，這也是造成腫瘤細胞具有異質性（heterogeneity）的一個原因。腫瘤細胞還可能會因為它們所處間質微環(huán)境（stromal microenvironment）釋放的一些信號而造成細胞生物學方面的改變，比如與EMT過程和MET過程有關的一些改變。正如在圖1中所示的那樣，在體內多處生長的腫瘤細胞都可能會接觸到能夠觸發(fā)EMT過程的信號。更重要的是，在多種臨床腫瘤中都發(fā)現(xiàn)，EMT過程與患者預后不良有關，這似乎是因為EMT轉換可以賦予原發(fā)瘤細胞更大的侵襲能力（aggressive trait）。自從我們發(fā)現(xiàn)了EMT轉換過程之后，科研工作者們就開始對該過程背后的分子機制展

6、開了研究，也逐漸取得了一定的成果，最近有幾篇非常精彩的綜述對EMT研究領域進行了很好的總結，讀者可以查閱這些文獻獲取更多有關EMT方面的信息。在簡略介紹有哪些分子機制能夠激活EMT過程之后，在本文中我們會將重點放到向讀者介紹最近一段時間剛剛發(fā)現(xiàn)的，那些能夠調控EMT過程后續(xù)表達過程的調控機制，還將就EMT轉換和MET轉換在腫瘤異質性中的作用，以及腫瘤進展和治療抗性中的作用展開討論。最后，我們還將對相關的醫(yī)療實踐進展做一個介紹。 H/E(Spl), hairy and enhancer of split發(fā)狀分裂相關增強子WNTR, Wnt receptor：Wnt蛋白受體圖1 參與調控

7、EMT過程的信號通路網絡簡介。圖中列舉了幾條參與EMT過程調控的信號通路，它們的下游效應因子，以及這些信號通路及細胞因子之間的相互作用。酪氨酸激酶受體（Receptor tyrosine kinases，RTK）、轉化生長因子（TGF）、Notch蛋白、內皮素A受體（endothelin A receptor，ETAR）、整聯(lián)蛋白（integrin）、Wnt蛋白、缺氧以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等這些信號都能通過各種信號通路誘發(fā)EMT轉換過程發(fā)生。在不同的細胞內，這些信號通路的地位（重要性）各有不同。EMT轉換和MET轉換都與細胞骨架和細胞外基

8、質，以及細胞間連接方式的改變有關。能誘發(fā)EMT轉換的信號可以通過蛋白磷酸化機制(比如TGF信號通路導致的PAR6A蛋白磷酸化)破壞緊密連接和橋粒連接。還可以通過抑制某些蛋白的表達水平（比如ZEB1抑制血小板親和蛋白3）來誘發(fā)EMT轉換。細胞外基質的重構也能觸發(fā)EMT過程，因為很多誘發(fā)EMT的因子都能上調細胞外基質蛋白（比如纖維連接蛋白fibronectin和膠原蛋白collagens）、蛋白酶（比如MMP）以及其他一些重構酶（比如賴氨酸氧化酶lysyl oxidase）的表達水平。缺氧、RAC1B活化以及某些激酶途徑（比如Akt激酶途徑）的激活也都能夠促進線粒體合成活性氧簇（reactive

9、oxygen species，ROS），包括缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF1)）、NF-B、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）等, 使細胞獲得多效性（pleiotropic effect）。除了各種信號通路之間的相互作用之外，促進EMT過程的細胞因子（圖中紫色圓圈表示轉錄因子）和miRNA之間也存在著非常復雜的相互調控作用。 背景小知識速覽上皮細胞和間質細胞之間的轉換是上皮細胞獲得可塑性以及腫瘤得以進展和出現(xiàn)腫瘤異質性的分子機制之一。 多種信號都能夠觸發(fā)上皮-間質轉換（epithelialm

10、esenchymal transition，EMT）過程，比如生長因子、腫瘤細胞與間質細胞間的相互作用以及缺氧等信號。各種能觸發(fā)EMT過程的信號和轉錄因子構成了一個非常重要的信息網絡。 EMT轉換能夠賦予腫瘤細胞干細胞樣的特征，比如能夠侵潤周圍組織，或者對某些治療措施或藥物具有抗性等。間質-上皮轉換（mesenchymalepithelial transition，MET）過程在將轉移的間質腫瘤細胞逆轉成為上皮細胞表型的過程中發(fā)揮了作用。最近發(fā)現(xiàn)microRNA也是一種EMT過程調控因子，這可能是由于 microRNA可以調控能夠誘發(fā)EMT過程的轉錄因子所致。 1. EMT

11、過程活化的機制有多種細胞外信號能夠激活EMT轉換過程，胞內的EMT下游信號通路與參與該過程的轉錄因子共同組成了一個復雜又意義重大的信號網絡，該信號網絡包含有多個正反饋回路（圖1）。這個復雜的相互作用網絡確保了細胞在EMT轉換后所獲得的間質細胞表型能夠穩(wěn)定的表達。最近有人對乳腺上皮細胞進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)持續(xù)激活的EMT轉換作用可以導致細胞進行性表觀改變（epigenetic alteration），最終導致細胞發(fā)生永久的可遺傳改變，使得細胞外誘導信號消失之后，細胞仍然能將間質細胞表型遺傳下去。因此，在某些特定情況下，EMT轉換過程能夠形成穩(wěn)定的表型改變，并且將這種表性遺傳下去，形成特定的細胞譜

12、系。1.1 參與EMT過程的信號通路EMT過程通常都是在上皮細胞中發(fā)生的，該過程可以由多種信號誘導觸發(fā)，其中尤以組成正常組織或腫瘤新生物組織（neoplastic tissue）的間質細胞所釋放的信號作用最為突出。轉化生長因子家族（TGF）成員是所有能誘導胚胎發(fā)育過程里EMT轉換過程的細胞因子中最重要，也是被研究得最透徹的一大類細胞因子，它們可以治療纖維變性性疾?。╢ibrotic diseases）和腫瘤性疾病。最近的研究結果還表明，TGF在調控乳腺癌干細胞（breast cancer stem cell）表型的過程中也起到了一定的作用，同時還發(fā)現(xiàn)TGF對于維持人胚胎干細胞（human em

13、bryonic stem cell）多向分化潛能具有關鍵性作用。后面這樣新發(fā)現(xiàn)說明TGF信號通路可能在所有腫瘤進程中為維持腫瘤細胞的干細胞狀態(tài)提供了幫助。TGF信號能夠通過多個不同的信號機制誘發(fā)EMT轉換過程，比如通過直接磷酸化SMAD轉錄因子配體活化受體（ligand-activated receptors of SMAD transcription factor）的途徑，以及通過某些能夠調控細胞極性和細胞間緊密連接形成過程的胞質蛋白來觸發(fā)EMT轉換過程。比如在乳腺上皮細胞中，TGF因子II型受體就能夠直接磷酸化SMAD2蛋白、SMAD3蛋白和細胞極性蛋白（cell polarity pro

14、tein）PAR6A。PAR6A蛋白硫酸化之后，細胞會喪失垂直方向的極性（apicalbasal polarity），同時，相鄰上皮細胞間業(yè)已形成的緊密連接（tight junctions）也會解體。TGF還能影響其它多個EMT觸發(fā)信號途徑的活性，比如Notch、Wnt以及整聯(lián)蛋白信號通路等。Wnt信號通路能通過抑制糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase -3，GSK3）介導的磷酸化作用以及抑制胞質中的連環(huán)蛋白（-catenin）降解等作用來誘發(fā)EMT轉換。胞內豐度大量增加的連環(huán)蛋白會轉移進入核內，作為轉錄因子亞單位誘導大量基因的表達，這些靶基因的表達產物中有很多都

15、是能夠誘導EMT轉換過程的轉錄因子。不過，連環(huán)蛋白自身是不能夠誘發(fā)EMT過程的。比如在大部分結腸直腸癌（colorectal carcinomas）細胞中，APC基因的失活或連環(huán)蛋白基因的激活都會提高胞內的連環(huán)蛋白水平。不過這些腫瘤細胞并沒有表現(xiàn)出間質細胞的特性，這說明連環(huán)蛋白信號通路雖然在某些細胞中能夠起作用，但是還不足以激活能觸發(fā)EMT過程的轉錄因子的表達（表1）。多項研究都發(fā)現(xiàn)了人乳腺癌上皮細胞鈣粘蛋白（epithelial cadherin，E- cadherin）的遺傳突變失活與表觀失活之間的差別，不過在乳腺癌細胞中很難觀察到核內連環(huán)蛋白積聚的現(xiàn)象。還有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的活性

16、在結腸直腸癌細胞中也有所升高，而這是因為幾個特異性沉默Wnt蛋白的關鍵基因，比如SOX17、SFRPs、DKK1等都被抑制的結果。這也從另一個方面進一步表明了Wnt信號通路的重要作用。 表1 在腫瘤細胞中與EMT轉換相關的基因以及它們和腫瘤臨床特征之間的聯(lián)系  Notch信號通路也在參與胚胎發(fā)生和腫瘤形成的 EMT轉換過程的調控工作中發(fā)揮了作用。Notch信號通路非常復雜，因為該通路中包含了多個受體、配體和下游調控因子。而且令情況更為復雜的是，Notch信號通路活化之后所造成的結果還具有細胞特異性，既有可能是促進腫瘤形成，也有可能會抑制腫瘤形成。Notch信號通路也能誘發(fā)E

17、MT過程，它主要是通過激活NF-B信號通路或者調控TGF信號通路的活性來發(fā)揮作用。Hedgehog信號通路也參與了EMT過程和腫瘤轉移過程。綜上所述，似乎參與了干細胞功能調控和生態(tài)位與干細胞間相互作用（nichestem cell interaction）調控的信號通路也都在EMT觸發(fā)過程中起到了一定的作用。這也同時表明，EMT過程與細胞獲得并維持干細胞樣特征有一定的關系。大量的酪氨酸蛋白激酶受體（receptor tyrosine kinases，RTK）也在和EMT過程相關的胚胎發(fā)育過程中起到了重要的作用，比如胚胎分支形態(tài)發(fā)生過程（branching morphogenesis）和胚胎心臟

18、瓣膜形成過程（cardiac valve formation）等。在某些腫瘤細胞中，這些RTK蛋白中的某一些蛋白發(fā)生了突變，表現(xiàn)為組成性激活（constitutively active）。還有一些細胞表面蛋白發(fā)生了改變，這也會促進EMT過程的發(fā)生。比如在多種腫瘤細胞中，上皮細胞鈣粘蛋白的表達都會因為遺傳或非遺傳的各種原因而缺失。于是在胞質中往往因為結合了一個上皮細胞鈣粘蛋白“尾巴”而受到限制的連環(huán)蛋白獲得了“解放”，然后如前文所述，連環(huán)蛋白得以進入核內，誘導能促進EMT過程的轉錄因子的表達。因此，RTK蛋白的組成型激活和上皮細胞鈣粘蛋白表達抑制這兩條途徑都會導致細胞獲得間質細胞特性，一旦細胞獲

19、得了這種特性，形成了腫瘤細胞，就可以不再需要腫瘤微環(huán)境中各種誘發(fā)EMT過程信號的刺激而持續(xù)保持間質細胞特性了。1.2 缺氧的作用 缺氧（Hypoxia）也是一種能夠誘發(fā)EMT過程的生理機制，它也是通過多種機制，比如上調缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF1）、肝細胞生長因子（hepatocytegrowth factor，HGF）、SNAI1以及TWIST1等蛋白的表達，激活Notch或NF-B信號通路，以及誘導DNA低甲基化等作用機制來誘發(fā)EMT過程的。3%的氧含量就能夠誘發(fā)多種人體腫瘤細胞發(fā)生EMT轉換，這主要是通過抑制GSK3的活性，從而限制了連環(huán)

20、蛋白的磷酸化過程和降解過程來發(fā)揮作用的。缺氧細胞會變得更富有侵襲性，胞內的Wnt-連環(huán)蛋白信號通路活性也會增強，因此能夠誘發(fā)EMT過程的轉錄因子SNAI1的表達量得以上升。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路的活化是缺氧誘導EMT過程發(fā)生的先決條件。缺氧可能還會激活細胞自我加強的正反饋途徑，幫助細胞維持間質細胞狀態(tài)。比如，SNAI1蛋白的活化能抑制上皮細胞鈣粘蛋白的轉錄，從而釋放出胞質里的連環(huán)蛋白，然后連環(huán)蛋白進入核內，激活并維持EMT誘發(fā)轉錄因子的表達。還有一些其它的胞外信號也能觸發(fā)EMT過程。比如有人對小鼠乳腺上皮細胞研究發(fā)現(xiàn)，該細胞能對異位表達的基質金屬蛋白酶3（matrix meta

21、lloproteinase 3，MMP3，又名間質溶解素1，stromelysin 1）做出反應，誘發(fā)EMT過程。MMP3蛋白是因為RAC1蛋白的剪接變異體RAC1B蛋白介導的活性氧簇（reactive oxygen specie）增多而出現(xiàn)的。1.3 上皮細胞與基質細胞間的相互作用可以調節(jié)EMT和MET過程 正如前文所述，在腫瘤中誘發(fā)EMT過程的因子通常都是起源于和腫瘤有關的基質，即形成腫瘤微環(huán)境的基質細胞中的各種信號通路。最開始有一些研究表明，間質細胞與上皮細胞間的相互作用在誘發(fā)EMT過程中也起到了一定的作用，它們能夠增加腫瘤細胞與基質發(fā)生相互作用的表面上多種EMT分子標志物的表達。這一點

22、已經在多種人體腫瘤細胞核動物腫瘤模型中得以證實。 腫瘤細胞由于受到了所處微環(huán)境的影響也會發(fā)生MET轉換。比如前列腺癌細胞與正常的肝細胞共培養(yǎng)時就會出現(xiàn)上皮細胞鈣粘蛋白表達上調的現(xiàn)象，隨后細胞會表現(xiàn)出已分化上皮細胞的特征。這種前列腺腫瘤細胞逆轉進入上皮細胞狀態(tài)的證據還包括一些其他的特征，比如在正常肝細胞與腫瘤細胞間出現(xiàn)了細胞間相互作用，這也是通過在細胞間形成同型上皮細胞鈣粘蛋白橋（homotypical E-cadherin bridges）來完成的。還有一個尚未解決的問題就是可擴散因子，尤其是生長因子和前文中提到的細胞因子是否參與了MET的誘導過程。可能還有一種缺省機制（default mec

23、hanism）應該也在EMT轉換過程中起到了同樣重要的作用，在沒有能夠促進細胞發(fā)生EMT轉換并維持間質細胞狀態(tài)的信號存在的情況下，很多正常的細胞和新生腫瘤細胞就會在這種缺省機制的作用下回復上皮細胞狀態(tài)。該理論似乎就可以解釋例如在轉移腫瘤細胞的生長階段發(fā)揮作用的MET過程。因此，在原發(fā)灶腫瘤細胞缺乏基質來源的EMT刺激信號的情況下，位于正常組織環(huán)境中的轉移瘤細胞可能會通過MET過程回復上皮細胞狀態(tài)。 背景知識1：胚胎發(fā)育過程中的EMT和MET轉換 已經有好幾篇非常精彩的綜述介紹了有關在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的上皮-間質細胞轉換（epithelialmesenchymal transitio

24、n，EMT）和間質-上皮細胞轉換（mesenchymalepithelial transition，MET）現(xiàn)象。EMT和MET轉換在好幾個發(fā)育進程中都起到了重要的作用。在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)最早的EMT轉換是在原腸胚形成期（gastrulation）時發(fā)生的間質細胞（mesenchymal cells）形成和中胚層（mesoderm）形成事件。胎盤（placenta）、前體節(jié)（somites）、心臟瓣膜（heart valves）、神經管嵴（neural crest）、泌尿生殖系統(tǒng)（urogenital tract）、繼發(fā)腭（secondary palate）等組織器官的形成過程以及胚胎多個器

25、官的分支形成過程（branching morphogenesis）中都有EMT和MET轉換作用的參與。轉化生長因子（transforming growth factor-）、Notch、Wnt、酪氨酸激酶受體信號通路等分子間的相互作用也都共同參與了在腫瘤發(fā)展進程中發(fā)揮作用的EMT和MET轉換過程。在胚胎發(fā)育過程中，與EMT作用相同的調控機制能夠將上皮細胞轉換成可遷移間質細胞，幫助器官的形成。但是在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程當中，該機制會異?；罨瑥亩龠M了腫瘤的浸潤和轉移。盡管這些機制當中存在著相似之處，但是在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用的EMT和MET和在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用的EMT和MET之間還是

26、存在著一些重要的區(qū)別，尤其是在某些腫瘤中，因為體細胞突變情況，所以上述轉換過程有可能是一種不可逆的過程。2. 遺傳控制和表觀遺傳控制有好幾個基因都參與了EMT的調控功能，研究發(fā)現(xiàn)，這些基因在腫瘤細胞中都會因為遺傳的或“后天的（表觀遺傳學）”作用而發(fā)生改變（背景知識2）。正如前文所述， 細胞會通過各種機制穩(wěn)定的缺失上皮細胞鈣粘蛋白。比如編碼上皮細胞鈣粘蛋白的CDH1基因突變就是遺傳性彌漫性胃癌（hereditary diffuse gastric cancer）的病因。而且在CDH1基因發(fā)生突變的人群中有一部分罹患乳腺小葉癌（lobular breast carcinomas）的風險也要明顯高于

27、常人。這同樣是因為，在乳腺小葉癌患者中，CDH1基因經常會出現(xiàn)體細胞性遺傳失活（somatic genetic inactivation），但CDH1基因失活也不一定會誘發(fā)EMT過程，這和我們前面提到的用RNA沉默方法抑制上皮細胞鈣粘蛋白表達的情況有所不同。 背景知識2：表觀調控機制 表觀調控機制包括DNA甲基化、染色質或組蛋白修飾、以及非編碼RNA調控等方式。每一種機制都在干細胞功能和干細胞分化，以及腫瘤形成過程中發(fā)揮了調控作用。比如DNA甲基化就在抑制基因表達，基因印記和X染色體失活等過程中發(fā)揮了重要作用。此外，DNA甲基化還與某些基因的細胞特異性表達現(xiàn)象有關。 DNA甲基化和基

28、因印記作用發(fā)生遺傳異常會引起胚胎發(fā)育缺陷，增加腫瘤的患病幾率。最近的研究還表明，DNA甲基化水平異常和染色質的改變會在細胞發(fā)生基因突變之前就能夠促進腫瘤形成。DNA甲基化過程和染色質修飾之間存在著相關性，非編碼RNA可能就是聯(lián)系它們之間的紐帶。在最近幾年里，我們新發(fā)現(xiàn)了好幾種組蛋白修飾方式以及參與組蛋白修飾過程的酶。最近又發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中，非編碼RNA與DNA甲基化和組蛋白修飾也有關，這也已經逐漸成為了非編碼RNA研究領域的一個新的發(fā)展方向。  通過這種對應機制的作用，那些所編碼的轉錄因子能夠特異性誘導細胞獲得干細胞表型的基因會發(fā)生低甲基化，從而促進EMT過程發(fā)生，在腫瘤細胞里則

29、表現(xiàn)為促使細胞去分化并增強其轉移能力。比如最近有人對干細胞樣的CD44+CD24細胞和來自正常組織或新生乳腺組織的已分化CD24CD44+細胞的DNA甲基化情況作了一個全面的分析。該研究發(fā)現(xiàn)了幾個能誘導EMT過程的轉錄因子，這些轉錄因子的編碼基因在CD44+CD24細胞中都表現(xiàn)為低甲基化水平，因此能夠高表達，而在CD24CD44+細胞中甲基化水平明顯增多。在MCF-12A細胞或MDCK細胞中異位表達FOXC1蛋白也能誘導EMT轉換現(xiàn)象出現(xiàn)，這是因為降低了胞內的上皮鈣粘蛋白表達水平，增加了波形蛋白（vimentin）的表達，促進了細胞的運動能力和浸潤能力?；谶@種基因低甲基化導致EMT的理論，有

30、人對MCF-7乳腺癌細胞給予5-氮雜胞苷（5-aza-cytidine）進行了實驗。5-氮雜胞苷是一種DNA甲基轉移酶（methyltransferase）抑制劑，它能上調與EMT過程相關的促細胞侵襲基因（pro-invasive EMT-associated gene）的表達，增強細胞的侵襲能力和轉移能力。這些研究結果提示我們，需要謹慎對待使用DNA甲基轉移酶抑制劑來治療乳腺癌的這種方法，因為這會增加腫瘤細胞的播散轉移風險。2.1 轉錄調控機制 圖1和表1中我們列舉了大概6至8種轉錄因子，它們被證實能夠調控胚胎發(fā)育過程和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的EMT作用。這些轉錄因子中既有能夠直接抑制上皮鈣粘蛋

31、白表達的SNAI1、SLUG（又名SNAI2）、SIP1（又名ZEB2）、E47（又名E2）等轉錄抑制因子（transcriptional repressors），也有TWIST1、FOXC2、FOXC1、GSC、ZEB1等間接對上皮鈣粘蛋白表達發(fā)揮作用的因子。越來越多的證據表明，這些轉錄因子間大量的相互作用使得它們能夠形成一個信息網絡，來誘導上皮細胞表現(xiàn)出間質細胞的表型并且長期維持這種表型。另外，還有一些轉錄因子，比如TWIST1還在抵抗細胞衰老，誘導腫瘤干細胞形成的過程中起到了關鍵性的作用。正如前文中所提到的，EMT誘導轉錄因子同時也能賦予上皮細胞干細胞的表型，見圖1。KIT受體這個在造血

32、系統(tǒng)中對維持造血細胞的干細胞狀態(tài)起到重要作用的因子也支持了上述理論，因為在小鼠和人體試驗中都發(fā)現(xiàn)，KIT蛋白能誘導SNAI2的表達。2.2 非編碼RNA對EMT和腫瘤轉移過程的調控作用我們現(xiàn)在越來越認識到非編碼RNA在基因表達調控方面占據了十分重要的地位。最近有好幾個研究都發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA能夠激活EMT程序，這些RNA包括miR200家族（miR200a、 miR200b、 miR200c、 miR141、miR429）和miR205等。同時還發(fā)現(xiàn)ZEB2基因的天然反義轉錄產物（anti-sense transcript）也具有同樣的功能。在所有這些研究中都發(fā)現(xiàn)了一個共同點，那就是在所有的E

33、MT調控途徑中，上皮鈣粘蛋白的表達都會受到抑制。有兩個獨立的研究團隊運用兩種完全不同的方法分別發(fā)現(xiàn)了miR200家族和miR205在EMT程序中的作用。在其中一項研究中發(fā)現(xiàn)，各種不同腫瘤細胞中的miRNA表達模式都與細胞表現(xiàn)為上皮細胞特征還是間質細胞特征有關，而這又可以通過上皮鈣粘蛋白（CDH1基因）和波形蛋白（vimentin，VIM基因）的mRNA水平來判斷。miR205的表達水平以及miR200家族成員的表達水平也都會隨著波形蛋白mRNA的表達水平而“反向運動”。后續(xù)的研究工作又發(fā)現(xiàn)，這些miRNA的靶標包括ZEB1和ZEB2這兩種能夠誘導EMT過程發(fā)生的轉錄因子，它們都能抑制上皮鈣粘蛋

34、白的表達。后來又在原發(fā)性人體卵巢漿液性乳頭狀癌（primary human serous papillary carcinomas of the ovary）中發(fā)現(xiàn)這些miRNA的表達都與CDH1基因呈正相關，與VIM基因呈負相關。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在馬-達二氏犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞中，細胞如果經TGF或者酪氨酸磷酸酶PEZ的誘導進入EMT程序之后，miR205和miR200家族成員的表達均有下調。ZEB1和ZEB2仍然是這些miRNA的作用靶標。而且，這些miRNA分子的表達下調足以誘導EMT過程的發(fā)生，同時如果異位表達這些miRNA分子，則能

35、夠誘發(fā)MET過程。還有一些科研人員在人結腸癌細胞中利用SNAI1誘導發(fā)生的EMT過程發(fā)現(xiàn)了另一種調控ZEB2基因mRNA水平的機制。細胞在SNAI1蛋白的誘導下進入EMT程序之后，ZEB2蛋白的表達會隨之增加，因為ZEB2基因的mRNA水平有所提高，但是并沒有發(fā)現(xiàn)ZEB2基因的轉錄水平有明顯的改變。Beltran等人結合了好幾種手段發(fā)現(xiàn)，ZEB2的表達是由一自然反義轉錄產物所調控的，該轉錄體能夠阻止包含有內部核糖體進入位點（internal ribosomal entry site）的5非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）中一大段內含子被剪接。該5UTR區(qū)還含有一段序列，

36、該序列能夠抑制核糖體掃描（ribosome scanning），從而降低mRNA的翻譯效率，導致上皮細胞中ZEB2蛋白的水平降低。不過在EMT程序激活時，這種反義轉錄產物的水平會升高，它與5UTR結合之后會抑制其剪接，從而保留了內部核糖體進入位點，增強了mRNA的翻譯效率，增加了ZEB2蛋白的水平，因此也就降低了胞內上皮鈣粘蛋白的含量。非編碼RNA通過對EMT和MET的調控也參與了腫瘤浸潤和轉移過程的調控。比如對轉移乳腺癌細胞和非轉移乳腺癌細胞中候選miRNA的分析表明，miR10b是與細胞獲得間質細胞表型和侵襲轉移能力有關的miRNA。隨后又有研究人員發(fā)現(xiàn)，miR10b能夠被TWIST1蛋白

37、誘導，而胞內TWIST1蛋白水平升高之后也會抑制HOXD10基因的表達，上調RHOC蛋白的水平，從而增強細胞的侵襲和轉移能力。還有一點需要提及的是，在出現(xiàn)轉移灶的患者體內原發(fā)腫瘤細胞中miR10b分子的表達水平會更高一些。與miR10b作用相反，有人對MDA-MB-231乳腺癌轉移細胞和非轉移細胞進行芯片分析之后發(fā)現(xiàn)，miR-335可以抑制腫瘤侵襲和轉移。miR-335似乎能夠通過影響轉錄因子SOX4和胞外基質蛋白粘蛋白C（tenascin C）的表達來抑制腫瘤轉移。Tavazoie等人還發(fā)現(xiàn)了一種miR-335基因標簽（gene signature），該標簽由6個基因組成，它們分別是COL1

38、A1、MERTK、PLCB1、PTPRN2、TNC和SOX4基因。這些基因的表達會受到miR-335的抑制，不過在轉移瘤細胞中，它們的表達水平會升高。這種miR-335基因標簽還與乳腺癌患者無轉移發(fā)生生存率較低的現(xiàn)象有關，這也說明了miR-335在腫瘤轉移調控中發(fā)揮了一定的作用。在將來，隨著發(fā)現(xiàn)鑒定非編碼RNA技術的進步，以及非編碼RNA功能研究手段的豐富，我們必將能夠發(fā)現(xiàn)更多的非編碼RNA在EMT和MET過程中發(fā)揮關鍵的調控作用?，F(xiàn)在，大家都逐漸認識到miRNA與細胞生理的各個方面都有聯(lián)系，因此我們有理由相信，miRNA和蛋白質一起，在細胞調控機制中發(fā)揮了主要作用。  3

39、. 間質細胞-上皮細胞轉換最近的研究表明，具有與EMT過程相關基因表達標簽的原發(fā)腫瘤發(fā)生轉移的可能性會更高，患者的無轉移生存時間也更短。不過我們反復觀察的結果卻是轉移灶腫瘤組織主要是由表現(xiàn)上皮細胞表型的腫瘤細胞組成，即與原發(fā)灶腫瘤細胞比較類似，但這種現(xiàn)象與上述EMT會促進腫瘤轉移的觀點看起來非常矛盾。如果腫瘤細胞必須經過EMT轉換才能播散轉移的話，為什么轉移灶腫瘤細胞會與原發(fā)灶細胞在組織學水平上如此相似呢？實際上，這并不矛盾，因為在腫瘤細胞經歷EMT轉換轉移到遠隔部位之后還會再經歷一個MET轉換，讓轉移瘤細胞回復到上皮細胞狀態(tài)（圖2）。有好幾項研究都表明，CDH1基因啟動子的DNA甲基化水平會

40、隨著腫瘤轉移的進程而不斷發(fā)生變化。在原發(fā)乳腺癌細胞中，腫瘤細胞會發(fā)生一個短暫的超甲基化，抑制CDH1基因的表達，增強腫瘤細胞的侵襲性和轉移能力，但是腫瘤細胞完成轉移之后，上皮鈣粘蛋白的表達又會再次增強，這是因為CDH1基因啟動子又經歷了一次去甲基化修飾。不幸的是，這些研究都沒有對腫瘤細胞進行克隆鑒定。還有一種可能就是原發(fā)腫瘤細胞中具有上皮細胞DNA甲基化狀態(tài)的腫瘤細胞發(fā)生了轉移，因此轉移灶處的腫瘤細胞也就表現(xiàn)為上皮細胞表型。因此，EMT-MET轉換理論還值得進一步的推敲、驗證。 圖2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞在上皮細胞狀態(tài)與間質細胞狀態(tài)之間轉換過程示意圖。在腫瘤原發(fā)灶中，EMT

41、過程和MET過程都與腫瘤細胞異質性（heterogeneity）現(xiàn)象有關，而腫瘤細胞異質性現(xiàn)象正是腫瘤難以治療以及容易發(fā)生轉移的一大原因。粒細胞和腫瘤相關成纖維細胞等間質細胞之間的相互作用可能會觸發(fā)EMT轉換過程，賦予上皮樣腫瘤細胞間質細胞或者腫瘤干細胞的表型，從而促進腫瘤細胞的生長和存活。腫瘤干細胞更容易發(fā)生轉移，也更容易從循環(huán)系統(tǒng)和微小轉移灶（micrometastases）中被檢出。不過臨床可見的巨大轉移灶（macroscopic metastases）更主要的是由分化更好的上皮樣腫瘤細胞所組成。這是因為在微小轉移灶形成之后，又會出現(xiàn)一個MET轉換，將EMT轉換得來的細胞回復成上皮樣腫瘤

42、細胞。之所以會出現(xiàn)這種回復過程可能是因為，在轉移灶處的局部選擇壓力使得具有上皮細胞表型的腫瘤細胞更適于生長，或者是因為缺乏EMT誘導信號的刺激。不過，我們也不能排除，是上皮樣腫瘤細胞和間質樣腫瘤細胞相互合作促使腫瘤轉移發(fā)生的。 背景知識3：小非編碼RNA最近發(fā)現(xiàn)的一些小非編碼RNA屬于一大類新型的基因表達調控因子，它們可能是在轉錄后水平發(fā)揮調控作用，可能還參與了表觀遺傳調控過程。在最近這幾年里，研究發(fā)現(xiàn)miRNA和piRNA對于干細胞的功能、細胞分化以及胚胎發(fā)育都是必須的。而且，miRNA還具有促進腫瘤形成和抑制腫瘤形成的作用，miRNA是一段1925bp長的單鏈RNA分子，它由Rn

43、ase III經過一系列催化作用得來。miRNA會參與形成miRNA誘導的沉默復合體（miRNA-induced silencing complexes，miRISC）。一種miRNA分子能與多種mRNA靶標結合，抑制其翻譯，甚至促進其降解。在某些情況下，miRNA還能通過某些未知機制影響基因轉錄。piRNA在生殖細胞（germ line）里起到了調控轉座子移動的作用，它們還可能在體細胞里參與細胞生理過程的調控，不過目前機制還不清楚。 4. EMT和MET的臨床重要性EMT轉換過程與腫瘤的兩大重要特性有關，這兩大特性分別是腫瘤轉移以及腫瘤抵抗治療。這兩大特性可能都與EMT轉換所導致的

44、腫瘤細胞干細胞樣特性有關。有兩個研究小組都分別發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細胞里能誘導EMT過程的轉錄因子TWIST1或SNAI1表達之后，通過細胞表面抗原檢測、基因表達譜檢測、能否形成mammosphere的檢測以及異體移植后能否形成導管等檢測方法發(fā)現(xiàn)，干細胞樣細胞的數(shù)量都會明顯增多，使用TGF也能得到同樣的結果。其中一個研究小組分別對從正常人體乳腺組織和原發(fā)乳腺癌組織中分離出的CD44+CD24細胞進行了與EMT過程有關基因表達情況的分析，結果發(fā)現(xiàn)能夠誘發(fā)EMT轉換的轉錄因子，比如TWIST1、 FOXC2、 SNAI1、 ZEB2 (又名SIP1)、TWIST2等，以及波形蛋白（vimentin）和

45、纖維連接蛋白（fibronectin）在CD44+CD24 干細胞樣腫瘤細胞中的表達水平要比在分化程度更高的CD44+CD24上皮樣腫瘤細胞中高的多。這些實驗結果加上以前的研究成果一起表明，在CD44+CD24乳腺癌腫瘤細胞中與腫瘤浸潤、轉移和血管生成相關的基因都有上調，同時細胞的侵襲和轉移能力也增強了。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，播散到循環(huán)系統(tǒng)和骨髓中的乳腺癌細胞中表現(xiàn)為CD44+CD24抗原表型的細胞數(shù)量也明顯增多。大量出現(xiàn)的CD44+CD24-干細胞樣腫瘤細胞以及與EMT過程相關的基因大量表達這些現(xiàn)象都與基底細胞樣乳腺癌有關（basal-like subtype of human breast c

46、ancer）。對479例乳腺癌樣品進行免疫組化分析后發(fā)現(xiàn)與EMT過程有關的蛋白，比如波形蛋白、平滑肌肌動蛋白（-smooth muscle actin）、神經鈣粘蛋白（neural cadherin，N-cadherin）、SPARC蛋白、層粘連蛋白（laminin）以及成束蛋白(fascin)等都會大量表達，而上皮鈣粘蛋白的表達量相比其他類型的乳腺癌細胞則會下降。這些腫瘤因為容易發(fā)生轉移，所以預后都比較差。另一個研究小組分析了117例原發(fā)侵襲性乳腺癌樣品中能誘發(fā)EMT轉換的轉錄因子FOXC2的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)該因子與基底細胞樣乳腺癌關系密切。結合這些實驗結果以及雙重免疫組化檢測（dual

47、immunohistochemical analysis）結果證明，基底細胞樣乳腺癌細胞就是CD44+CD24腫瘤細胞。EMT轉換機制對于腫瘤抵抗臨床治療也具有十分重要的作用。在經過標準化療之后的腫瘤“殘余”灶中，剩余的腫瘤細胞大部分都是干細胞樣腫瘤細胞。比如給予乳腺癌患者新輔助療法（neoadjuvant therapy）和標準的蒽環(huán)霉素及紫杉烷化療（anthracycline-taxane chemotherapy）之后，在活檢組織中可以發(fā)現(xiàn)，表達有與EMT過程相關基因的CD44+CD24細胞的數(shù)量明顯增多。但是對ERBB2+的乳腺癌患者用表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）和ERBB2雙重抑制劑拉帕替尼泊（lapatinib）治療之后則不會出現(xiàn)這種情況。對于某些腫瘤而言，比如肺癌和結腸癌，細胞經歷EMT轉換之后，對于EGFR激酶抑制劑的敏感性會降低，這可能是因為細胞活化了EGFR激酶的下游因子PI3K和Akt，從而不再需要EGFR激酶信號通路的作用。EMT轉換作用和腫瘤細胞隨即表現(xiàn)出來的腫瘤干細胞特征也都與腫瘤細胞的抗凋亡機制相關。對EpH-4和NMUMG鼠乳腺上皮使用TGF誘導EMT作用之后，這些上皮細胞都對紫外線誘導的凋亡機制產生了抵抗作用。同樣，在乳腺癌細胞中，下調le