蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù). .一、免疫學(xué)一、免疫學(xué)n研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；n免疫應(yīng)答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能；免疫應(yīng)答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能；n抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的規(guī)律。抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的規(guī)律。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在一起，并且發(fā)展成了很免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在一起，并且發(fā)展成了很多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。n隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動(dòng)物體內(nèi)存在著具有免疫功能

2、隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動(dòng)物體內(nèi)存在著具有免疫功能的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系統(tǒng)）。的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系統(tǒng)）。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 淋巴組織淋巴組織免疫活性細(xì)胞免疫活性細(xì)胞免疫活性介質(zhì)免疫活性介質(zhì) 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院5免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn)免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn)功能名稱功能名稱 生理功能生理功能 病理表現(xiàn)病理表現(xiàn)免疫防御免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性異物清除病原微生物及其它抗原性異物 超敏反應(yīng)（強(qiáng)）超敏反應(yīng)（強(qiáng)） 免疫缺陷?。ㄈ酰┟庖呷毕莶。ㄈ酰┟庖咦苑€(wěn)免疫自穩(wěn) 清除損傷或衰老細(xì)胞清除損傷或衰老細(xì)胞 自身免疫性疾病自身免疫性疾病

3、免疫監(jiān)視免疫監(jiān)視 清除突變或畸變細(xì)胞清除突變或畸變細(xì)胞 防止腫瘤發(fā)生防止腫瘤發(fā)生 腫瘤或病毒持續(xù)性腫瘤或病毒持續(xù)性 殺傷病毒感染細(xì)胞殺傷病毒感染細(xì)胞 感染感染n當(dāng)外源異體物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可以激當(dāng)外源異體物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對(duì)外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機(jī)體免受外源物質(zhì)活機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對(duì)外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機(jī)體免受外源物質(zhì)的侵害。的侵害。n機(jī)體的這一特異免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞。機(jī)體的這一特異免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 n免疫應(yīng)答的類型免

4、疫應(yīng)答的類型（一）固有性免疫應(yīng)答（一）固有性免疫應(yīng)答（innate immune response)innate immune response) 又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中形成的免疫防御功能。程中形成的免疫防御功能。（二）適應(yīng)性免疫應(yīng)答（二）適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptive immune responseadaptive immune response） 又稱獲得性免疫應(yīng)答，特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體出生后通過(guò)與抗原物質(zhì)又稱獲得性免疫應(yīng)答，特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體出生后通過(guò)與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的

5、一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性）性、自限性） 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院抗原和免疫原性抗原和免疫原性n抗原（抗原（antigensantigens，AgAg）是指能夠刺激機(jī)體免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏）是指能夠刺激機(jī)體免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。n常見的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素常見的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素等有機(jī)物。等有機(jī)物。n抗原具有

6、兩方面的特性：免疫原性（抗原具有兩方面的特性：免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）和免疫反應(yīng)性）和免疫反應(yīng)性（immunoreactivityimmunoreactivity）。）。q免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）是指抗原刺激機(jī)體引起免疫應(yīng)答的能）是指抗原刺激機(jī)體引起免疫應(yīng)答的能力。力。q免疫反應(yīng)性（免疫反應(yīng)性（immunoreactivityimmunoreactivity）是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物）是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物( (即即抗體抗體) )在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合

7、反應(yīng)的能力。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院抗原的分類抗原的分類n抗原可以分為完全抗原和半抗原?？乖梢苑譃橥耆乖桶肟乖?。n完全抗原：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為完全抗原（完全抗原：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為完全抗原（complete complete antigenantigen） n半抗原：只具有免疫反應(yīng)性而無(wú)免疫原性的抗原稱為半抗原（半抗原：只具有免疫反應(yīng)性而無(wú)免疫原性的抗原稱為半抗原（haptenhapten），），也稱為不完全抗原也稱為不完全抗原(incomplete antigen)(incomplete antigen)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗。與蛋

8、白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原。多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院抗體的種類抗體的種類n抗體（抗體（antibodiesantibodies，Ab)Ab)是專門對(duì)抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為是專門對(duì)抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulins, Ig)immunoglobulins, Ig)。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機(jī)。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機(jī)體免疫作用的主要物

9、質(zhì)。體免疫作用的主要物質(zhì)。n免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型：免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型： IgGIgG、 IgAIgA、 IgMIgM、 IgDIgD和和IgEIgE。n人體血清中人體血清中IgGIgG含量最多，含量最多， IgAIgA次之，次之， IgMIgM較少，較少， IgDIgD和和IgEIgE微量。微量。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n抗原抗體反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibody reactionantigen-antibody reaction）n是指抗原與相應(yīng)

10、抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（in in vivovivo），也可發(fā)生于體外（），也可發(fā)生于體外（in vitroin vitro）。）。n體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；n體外反應(yīng)：可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種體外反應(yīng)：可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。不同的反應(yīng)類型。n因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多采用血清作試驗(yàn)，所以因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多采用血清

11、作試驗(yàn)，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)（體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologic reactionserologic reaction）。）。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院二、印跡法（二、印跡法（blotting）n印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。樣品的一種方法。n19751975年，年，SouthernSouthern建立了將建立了將DNADNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NCNC膜）上，并利膜）上，并利用用DNADNARNARNA雜交檢測(cè)特定

12、的雜交檢測(cè)特定的DNADNA片段的方法，稱為片段的方法，稱為Southern Southern 印跡法。印跡法。n人們用類似的方法，對(duì)人們用類似的方法，對(duì)RNARNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNARNA的印跡分析稱的印跡分析稱為為NorthernNorthern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為WesternWestern印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為EasternEastern印跡印跡法法 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院三、蛋白免疫印三、蛋白免

13、疫印跡跡的應(yīng)用的應(yīng)用n免疫印跡法免疫印跡法 (immunoblotting test,IBT)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITBn是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。n具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。n是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)免疫印跡

14、檢測(cè)技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)儀器三、實(shí)驗(yàn)儀器四、操作步驟四、操作步驟五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析六、思考題六、思考題 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)習(xí)掌握動(dòng)物抗血清的制備原理及技術(shù)學(xué)習(xí)掌握動(dòng)物抗血清的制備原理及技術(shù)n通過(guò)實(shí)際操作學(xué)會(huì)動(dòng)物抗血清的制備通過(guò)實(shí)際操作學(xué)會(huì)動(dòng)物抗血清的制備n掌握掌握WesternWesternblottingblotting的基本原理的基本原理 n熟悉熟悉WesternWesternblottingblotting的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

15、科學(xué)學(xué)院二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n第一部分第一部分 動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備n第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 檢測(cè)抗血清檢測(cè)抗血清 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，動(dòng)物血清中可出現(xiàn)大量特將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，動(dòng)物血清中可出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為免疫血清。異性抗體，這種含抗體的血清稱為免疫血清。n優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動(dòng)物應(yīng)答的優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動(dòng)物應(yīng)答

16、的能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時(shí)間間隔、有無(wú)佐能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時(shí)間間隔、有無(wú)佐劑等因素。劑等因素。第一部分第一部分 動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（一）多克隆抗體的概念（一）多克隆抗體的概念n抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的?？乖ǔＪ怯啥鄠€(gè)抗原決定簇組成的。n由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（稱之為單克隆抗體（Monoclone antibodyMonocl

17、one antibody）。）。n由多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這由多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。n機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體。機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院抗體的結(jié)構(gòu)抗體的結(jié)構(gòu) 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（二）用于免疫的動(dòng)物（二）用于免疫的動(dòng)物n由于動(dòng)物的遺傳性不同，同一抗原對(duì)不同動(dòng)物或同種不同品系動(dòng)物、或不同由于動(dòng)物的遺傳性不同，同一抗原對(duì)不同動(dòng)物或同種不同品系動(dòng)物、或不同個(gè)體，產(chǎn)生特異免疫

18、應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此，進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)，必須選個(gè)體，產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此，進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)，必須選擇對(duì)該抗原敏感的、年輕的健康動(dòng)物。擇對(duì)該抗原敏感的、年輕的健康動(dòng)物。n常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般為6 6個(gè)月大小的動(dòng)物。個(gè)月大小的動(dòng)物。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量。q如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物；如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物；q如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物；如要是

19、獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物；q如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗體；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗體；q如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備。如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備。n一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。提供足夠數(shù)量的血清。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（三）抗原（三）抗原n抗原是多種多樣的，就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗

20、原、類脂抗原、多糖類抗原是多種多樣的，就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等?？乖秃怂峥乖?。n為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原。n不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不相同，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)等。的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)等。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（四）免疫途徑（四）免疫途徑n免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮

21、內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等。結(jié)內(nèi)注射等。n一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1mL0.1mL左右。左右。n實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)中0.2mL0.2mL，3 34 4點(diǎn)注射。點(diǎn)注射。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n皮下注射皮下注射 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（五）佐劑（五）佐劑n應(yīng)用佐劑的目的是為了提高抗原對(duì)機(jī)體的免疫原性，從而提高抗體的效價(jià)。應(yīng)用佐劑的目的是為了提高抗原對(duì)機(jī)體的免疫原性，從而提高抗體的效價(jià)。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿佐劑主要可分為兩種：一

22、種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無(wú)免疫原性，如菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無(wú)免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。n目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑福氏佐劑。目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑福氏佐劑。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n福氏佐劑（福氏佐劑（Freund adjuvantFreund adjuvant）, , 通常是由羊毛脂通常是由羊毛脂1 1份、石臘油份、石臘油5 5份。這是不份。這是不完全福氏佐劑。完全福氏佐劑。n在每毫升不完全佐劑加入在每毫升不完全佐

23、劑加入1 120mg20mg卡介苗就成為完全佐劑?？ń槊缇统蔀橥耆魟?河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（六）免疫方法（六）免疫方法n抗原劑量，首次劑量為抗原劑量，首次劑量為101050g50g，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量的，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量的1/41/4。n首次免疫時(shí)抗原與完全佐劑等體積混合。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑。首次免疫時(shí)抗原與完全佐劑等體積混合。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑。n每每2 23 3周加強(qiáng)免疫一次。周加強(qiáng)免疫一次。n在第在第2 2次加強(qiáng)免疫后次加強(qiáng)免疫后2 2周，從耳緣靜脈取周，從耳緣靜脈取2 23mL3mL血，制備血清，檢測(cè)抗體血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)。如未

24、達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n抗體的產(chǎn)生順序與豐度抗體的產(chǎn)生順序與豐度 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（七）抗血清的采集與保存（七）抗血清的采集與保存n取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈放血，也可心取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈放血，也可心臟采血。臟采血。 n小鼠取血。小鼠取血。n收集的血液置于室溫下收集的血液置于室溫下1h1h左右

25、，凝固后，置左右，凝固后，置44下，過(guò)夜（切勿冰凍）析出血下，過(guò)夜（切勿冰凍）析出血清，離心，清，離心，4000rpm,10min4000rpm,10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（0.050.050.2mL0.2mL），），貯于貯于-80-80以下冰箱，或凍干后貯存于以下冰箱，或凍干后貯存于4 4冰箱保存。冰箱保存。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院（八）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)（八）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)n在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能

26、發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。的抗血清。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n效價(jià)效價(jià) 抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是單向擴(kuò)散免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。的方法常用的是單向擴(kuò)散免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。n某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。某

27、些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n單向擴(kuò)射免疫法：?jiǎn)蜗驍U(kuò)射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h24h后，后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%50%的血清稀度和為效價(jià)。的血清稀度和為效價(jià)。q如某抗血清的結(jié)合率為如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為時(shí)的稀釋度為1：15000,則該血清的效價(jià)就是則該血清的效價(jià)就是1：15000 n制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（抗體固定不變）。打孔，加入不同制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（

28、抗體固定不變）。打孔，加入不同稀釋度的抗原量，進(jìn)行免疫擴(kuò)散?？乖c相應(yīng)抗體在濃度合適時(shí)，則形成清稀釋度的抗原量，進(jìn)行免疫擴(kuò)散?？乖c相應(yīng)抗體在濃度合適時(shí)，則形成清晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成正比。將已知晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成正比。將已知參考抗原形成的沉淀參考抗原形成的沉淀環(huán)繪成曲線，然后以待測(cè)標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)抗原的環(huán)繪成曲線，然后以待測(cè)標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。含量。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生雙向擴(kuò)散法

29、：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。雙向免疫擴(kuò)散 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 1 1抗原；抗原；2 27 7為不同稀釋倍數(shù)的抗體為不同稀釋倍數(shù)的抗體 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院39分分 子子 雜雜 交交 原原 理理 及及 流流 程程 圖圖樣樣 品品 制制 備備電電 泳泳雜雜 交交轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 膜膜結(jié)果顯示結(jié)果顯示探探 針針 制制 備備第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 檢測(cè)抗血清檢測(cè)抗血清

30、 Western BlotWestern Blot原理原理n將通過(guò)將通過(guò)PAGEPAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜上；膜上；n然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)；n洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后；洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后；n加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體；滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體；n加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的加入適合標(biāo)記物的檢

31、測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)。出現(xiàn)。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n免疫印跡的實(shí)驗(yàn)包括五個(gè)步驟：免疫印跡的實(shí)驗(yàn)包括五個(gè)步驟：n 固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。素膜上。n 封閉：保持膜上沒有抗體的結(jié)合場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以避免特封閉：保持膜上沒有抗體的結(jié)合場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以避免特殊性抗體單獨(dú)結(jié)合到膜上。殊性抗體單獨(dú)結(jié)合到膜上。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院l一抗雜交：初級(jí)抗體

32、（第一抗體）是特異性的。一抗雜交：初級(jí)抗體（第一抗體）是特異性的。n二抗雜交：第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。二抗雜交：第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。n底物顯色：被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)底物顯色：被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。的顏色反應(yīng)。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院三、實(shí)驗(yàn)儀器三、實(shí)驗(yàn)儀器n動(dòng)物的常規(guī)免疫動(dòng)物的常規(guī)免疫n WesternWesternblotting blotting 檢測(cè)抗血清檢測(cè)抗血清 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院動(dòng)物的常規(guī)免疫動(dòng)物的

33、常規(guī)免疫n注射器注射器n蝸旋混合器蝸旋混合器 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院四、操作步驟四、操作步驟n動(dòng)物的常規(guī)免疫動(dòng)物的常規(guī)免疫n WesternWesternblotting blotting 檢測(cè)抗血清檢測(cè)抗血清 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n抗原的提取與制備抗原的提取與制備 1 1）0.5mg/mL0.5mg/mL菠蘿蛋白酶以菠蘿蛋白酶以0.9%0.9%生理鹽水溶解配置（加少量生理鹽水溶解配置（加少量NaOHNaOH促溶）促溶）（周二上、周五上）。（周二上、周五上）。 2 2）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）。）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）。 3 3）1mg/mL

34、1mg/mL酪蛋白以酪蛋白以0.9%0.9%生理鹽水溶解配置（加少量生理鹽水溶解配置（加少量NaOHNaOH促溶）促溶） （周四下（周四下午）。午）。 動(dòng)物的常規(guī)免疫動(dòng)物的常規(guī)免疫 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院48苦味酸（以苦味酸（以75%75%乙醇配置）標(biāo)記小鼠乙醇配置）標(biāo)記小鼠標(biāo)記部位標(biāo)記部位組號(hào)組號(hào)頭頭1左前肢左前肢2左后肢左后肢3背背4右前肢右前肢5右后肢右后肢6左耳朵左耳朵7右耳朵右耳朵8n初級(jí)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，初級(jí)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，0.2mL/0.2mL/只小鼠只小鼠 （1 1）抗原與佐劑的混合：取）抗原與佐劑的混合：取1.5mL1.5mL蛋白與蛋白

35、與1.5mL1.5mL完全佐劑混合，震蕩混勻，制完全佐劑混合，震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)成油包水的形態(tài) （2 2）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （3 3）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于0.1mL0.1mL 初級(jí)免疫后仔細(xì)觀察小鼠對(duì)外源抗原的反應(yīng)，兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫初級(jí)免疫后仔細(xì)觀察小鼠對(duì)外源抗原的反應(yīng)，兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院n加強(qiáng)免疫：初級(jí)免疫后兩周進(jìn)行。加強(qiáng)免疫：初級(jí)免疫后兩周進(jìn)行。n取取1.5mL1.5mL蛋白與蛋白與1.5mL1.5mL不完全佐劑混合震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)。不完全佐劑混合震蕩混

36、勻，制成油包水的形態(tài)。n加強(qiáng)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，加強(qiáng)免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，0.15mL/0.15mL/只小鼠只小鼠 （1 1）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （2 2）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于）皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量應(yīng)小于0.1mL0.1mL。n第二次加強(qiáng)免疫：加強(qiáng)免疫一周后進(jìn)行。操作相同。第二次加強(qiáng)免疫：加強(qiáng)免疫一周后進(jìn)行。操作相同。n第二次加強(qiáng)免疫后一周，即可采血，收集抗血清。第二次加強(qiáng)免疫后一周，即可采血，收集抗血清。n小鼠取血。收集的血液置于室溫下小鼠取血。收集的血液置于室溫下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下，析出血清，離心，下，

37、析出血清，離心，3000rpm,10min3000rpm,10min。吸出血清，分裝（。吸出血清，分裝（0.050.050.2mL0.2mL），貯于），貯于-20-20以下冰箱保存。以下冰箱保存。 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院Western BlotWestern Blot一般流程一般流程n蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備nSDSSDSPAGEPAGEl轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院轉(zhuǎn)移電泳設(shè)備 Western Westernblotting blotting 檢測(cè)抗血清檢測(cè)抗血清 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院 河北大學(xué)生命河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)學(xué)院轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜膜的選擇膜的選擇尼龍膜尼龍膜硝酸纖硝酸纖維素膜維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體結(jié)合簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價(jià)格昂貴價(jià)格昂貴價(jià)格便宜價(jià)格便宜特殊要求下的選擇特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：（尼龍膜： 480g/cm2 ；硝酸纖維素膜：；硝酸纖維素膜：80g/cm2 ）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機(jī)械