實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白課件

1、實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白1實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白2n掌握聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的原理；掌握聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的原理；n學習聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的操作技術；學習聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的操作技術；n了解血清蛋白的主要成份。了解血清蛋白的主要成份。一、實驗目的一、實驗目的實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白3二、實驗原理二、實驗原理 不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白樣品通過濃縮膠的濃不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白樣品通過濃縮膠的濃縮按分子大小排列成層，然后進入分離膠，隨著電泳的不斷進行縮按分子大小排列成層，然后進入分離膠，隨著電泳的不斷進行，不同

2、大小、電荷的蛋白質(zhì)分子逐漸被分開。，不同大小、電荷的蛋白質(zhì)分子逐漸被分開。 實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白4bis將單體長鏈連成網(wǎng)狀結構將單體長鏈連成網(wǎng)狀結構temed催化催化ap生成硫酸自由基生成硫酸自由基1、聚丙烯酰胺凝膠生成、聚丙烯酰胺凝膠生成催化催化acracr聚合成長鏈聚合成長鏈acr：丙烯酰胺：丙烯酰胺bis：甲叉雙丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺ap：過硫酸胺（催化劑）：過硫酸胺（催化劑）temed： n, n, n,n-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（加速劑）加速劑）acr、bis決定孔徑大小決定孔徑大小ap、temed決定聚合速度決定聚合速度實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清

3、蛋白5n 連續(xù)膠電泳連續(xù)膠電泳 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)（樣品緩沖液、凝膠緩沖液采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)（樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液），在和電極緩沖液），在ph恒定、離子強度相同的條件下進行。恒定、離子強度相同的條件下進行。l 優(yōu)點：優(yōu)點： 制膠簡單、快捷制膠簡單、快捷 緩沖液緩沖液ph值恒定，可以防止樣品進膠后因值恒定，可以防止樣品進膠后因ph值改變發(fā)生的凝聚和沉淀值改變發(fā)生的凝聚和沉淀 緩沖系統(tǒng)組成簡單，來源廣泛緩沖系統(tǒng)組成簡單，來源廣泛l 缺點：缺點： 分辨率不高分辨率不高2、連續(xù)膠和不連續(xù)膠電泳、連續(xù)膠和不連續(xù)膠電泳實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白6

4、n 不連續(xù)膠電泳不連續(xù)膠電泳 采用不相同孔徑的凝膠和不同緩沖系統(tǒng)的電泳方式，在電泳分離過程中，由采用不相同孔徑的凝膠和不同緩沖系統(tǒng)的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠界面上先濃縮成一窄帶，然后于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離。在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離。l 優(yōu)點：優(yōu)點： 分辨率高分辨率高 用于復雜和特殊樣品的分離用于復雜和特殊樣品的分離實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白7l 不連續(xù)電泳的三種物理效應不連續(xù)電泳的三種物理效應 樣品的濃縮效應樣品的濃縮效應 凝膠的分子篩

5、效應凝膠的分子篩效應 電荷效應電荷效應 電泳的過程三種效應同時存在，對蛋白樣品起協(xié)同作用，使樣品各組電泳的過程三種效應同時存在，對蛋白樣品起協(xié)同作用，使樣品各組分按照帶電量、分子質(zhì)量及形狀按一定的順序分離。分按照帶電量、分子質(zhì)量及形狀按一定的順序分離。l不連續(xù)電泳的四種不連續(xù)體系不連續(xù)電泳的四種不連續(xù)體系凝膠的不連續(xù)凝膠的不連續(xù)緩沖液成份的不連續(xù)緩沖液成份的不連續(xù)緩沖液緩沖液ph值的不連續(xù)值的不連續(xù)電壓梯度的不連續(xù)電壓梯度的不連續(xù)實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白8三、實驗步驟三、實驗步驟n封槽封槽 清潔、干燥的小玻管一端，用清潔、干燥的小玻管一端，用parafilm貼封后垂直放在管架上

6、貼封后垂直放在管架上 實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白9l分離膠：分離膠：a:c:d:e1:2:3:2（v/v）l濃縮膠：濃縮膠：b:c:d:e2:1:5:2（v/v）a: ph8.9 tris/hcl緩沖液緩沖液b: ph6.7 tris/hcl緩沖液緩沖液c: 30% acr-bis貯存液貯存液d: 水水e: 過硫酸銨過硫酸銨 灌裝前加入灌裝前加入temed，混勻，混勻 取干凈玻璃管，下端封口膜封好（取干凈玻璃管，下端封口膜封好（重要重要）；用注射器加分離膠至管口）；用注射器加分離膠至管口1-1-2cm2cm處，封水（沿管壁，動作要慢）；凝固后棄水、吸干；加濃縮膠距管口處，封水（沿

7、管壁，動作要慢）；凝固后棄水、吸干；加濃縮膠距管口2-3mm2-3mm處、封水；凝固后備用。處、封水；凝固后備用。制膠和灌膠制膠和灌膠實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白10n加樣加樣n電泳電泳n剝膠剝膠實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白11n染色染色 將凝膠柱置于將凝膠柱置于0.05%氨基黑氨基黑10b溶液中浸染溶液中浸染20min，然后再浸，然后再浸入入7%醋酸溶液中醋酸溶液中 脫色。脫色。 血清蛋白在凝膠柱上可分出十多條色帶。血清蛋白在凝膠柱上可分出十多條色帶。實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白12 分離膠和濃縮膠中分離膠和濃縮膠中a,b,c,d,ea,b,c,d,e各是什么組分。各是什么組分。 分離膠和濃縮膠中緩沖液的組分，分離膠和