枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣

1、枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣 · 108 · 文章編號(hào)：10001336(2005)02-0108-03 生命 2oo5年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) Mini Reviews 枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣 劉燕秦玉昌 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院飼料研究所，北京100081) 摘要： 芽孢衣是賦予芽孢對(duì)有機(jī)溶劑和溶菌酶的抗性，以及對(duì)外界出芽誘導(dǎo)物的感應(yīng)能力的保護(hù)性結(jié)構(gòu)。該文 主要介紹由枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)所形成的芽孢的芽孢衣中已鑒定的主要蛋白質(zhì)，及其基因表達(dá)調(diào)控和 應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展。 關(guān)鍵詞：芽孢衣：形態(tài)建成蛋白

2、質(zhì)(morphogenetic protein)；表面展示蛋白質(zhì) 中圖分類號(hào)：Q934 芽孢是某些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌用于抵抗不良環(huán) 境的休眠結(jié)構(gòu)。從開(kāi)始形成到結(jié)束大約需要810 h。在芽孢形成的初期，首先是經(jīng)歷不對(duì)稱分裂 形成大小不等的兩個(gè)細(xì)胞。大的為母細(xì)胞 (mother cel1)， 小的為前芽孢(forespore)。各自包 裹一部分染色體。然后前芽孢內(nèi)陷進(jìn)入母細(xì)胞， 形成大細(xì)胞中包裹小細(xì)胞的形式。大小細(xì)胞經(jīng)歷 不同的發(fā)育過(guò)程，前芽孢最終發(fā)育為芽孢，而母 細(xì)胞則為前芽孢的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)成分。 收稿日期：2004一l130 作者簡(jiǎn)介：劉燕(1982一)，女，碩士生，Email：liuyan

3、llhyahoo Com Cn 芽孢的高度抗性主要依賴于高度脫水的核心 (core)及包裹芽孢的兩層結(jié)構(gòu)：皮層(the cortex) 和芽孢衣(the spore coat)。在芽孢衣的組裝過(guò)程中 基因表達(dá)的調(diào)控?zé)o疑是不可缺少的，但存儲(chǔ)于蛋 白質(zhì)本身或輔助蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息對(duì)蛋白質(zhì)的正 確定位也起到很重要的作用。已分離出幾種指導(dǎo) 其他蛋白質(zhì)正確定位的形態(tài)建成蛋白質(zhì)：并提出 了芽孢衣的初步組裝模型。芽孢衣蛋白質(zhì)的自我 組裝已經(jīng)成為研究生物大分子自我組裝的模型。 芽孢還被用作載體，利用其芽孢衣蛋白質(zhì)來(lái)展示 其他外源蛋白質(zhì)。 1芽孢衣的形態(tài)和蛋白質(zhì)組成 病毒載體，即新構(gòu)建的CRAd、作為陽(yáng)性對(duì)照的

4、含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的腺病毒(AdCMVE1A)及 作為陰性對(duì)照的復(fù)制缺陷型腺病毒，以比較新構(gòu) 建CRAd的效力：還需設(shè)定檢測(cè)時(shí)間及設(shè)定病毒 不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)， 以綜合評(píng)價(jià)其復(fù)制水平和溶瘤能力：此外。還要 構(gòu)建體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型。 臨床前評(píng)價(jià)應(yīng)包括體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分。 體外實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行如感染病毒后 正常及靶腫瘤細(xì)胞成活率分析： 而病毒復(fù)制能力 分析則可采用Western 印跡法、空斑測(cè)定(plaque assay)及逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)fRTPCR) 等。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建動(dòng)物模型后，瘤內(nèi)注射一定 量的病毒監(jiān)測(cè)異種移植瘤生

5、長(zhǎng)情況并跟蹤小鼠 成活期；還需小鼠尾靜 脈注射病毒，一定時(shí)間 后，取小鼠肝、脾等器官進(jìn)行組織病理分析以評(píng) 價(jià)新構(gòu)建CRAd載體的毒性 m1。 近幾年來(lái)，CRAd已成為有前途的新型癌癥 基因治療載體。尤其它在臨床前實(shí)驗(yàn)階段所顯示 出的強(qiáng)有力的溶瘤作用為實(shí)體瘤的治療帶來(lái)了 新的希望。而且， 隨著對(duì)病毒生物學(xué)方面知識(shí)不 斷深入的了解，將引導(dǎo)我們?cè)谠鰪?qiáng)病毒靶向型、 基因轉(zhuǎn)移效率、腫瘤特異性復(fù)制的調(diào)控及在人體 內(nèi)的穩(wěn)定性方面進(jìn)行更為深入的研究，從而構(gòu)建 出復(fù)制效率更高、特異性更強(qiáng)、應(yīng)用范圍更廣的 CRAd載體 參 考 文 獻(xiàn) Kirn D et a1Nat Med20017：78l一787 Doroni

6、n K et af、J Wm 2ooO74：6l47 6l55 Kanerva A et a1nt J Cancer,20o41l0：475 480 Nettelbeck DM et a1Cancer Res，2002，62：4663- 4670 Hallenbeck PL ef afHum Gene Ther,l9991O：l72l l733 Yu DC ef afCan cer Res20o16l：5l7 525 akubczak JL et aCancer Res，20O363：1490- 1499 Yamamoto M et a1Gastroenterology2003125：l203

7、一l2l8 Kancl'va A et afC,ene Ther,20o41l：552 559 Huang Q et a1c 抽Cancer Res200410：l4391445 Irving J et a1Can cer Gene Ther,20o41l：l74一l85 Song JSBiosci Biotechnol Biochem20048：l634 1639 小綜述 A 生命的化學(xué)>2005年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) 外膜 內(nèi)膜 皮層 外膜 內(nèi)膜 皮層 B C D 圖l 芽孢衣組裝模型【11 MC，母細(xì)胞；FS，

8、前芽孢；JA，CotjA；jc，CotjC；A，CotA；M，CotM；H，CotH；D，CotD；S，CotS；T，CotT；G，CotG；B，CotB 芽孢衣是由富含酪氨酸和半胱氨酸的多肽組 成的層狀結(jié)構(gòu)。不同菌種形成的芽孢的組成芽孢 衣的多肽數(shù)目差別很大，從蠟樣芽孢桿菌中僅以 一種為主到枯草桿菌中達(dá)25種之多。在電鏡下觀 察，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)所形成的芽孢 的芽孢衣分為三層：不定型的底層(undercoat)、片 狀的內(nèi)層及密電子具殼紋的外層。內(nèi)層大約寬75 nm主要由CotD、CotH、CotS和CotT等蛋白質(zhì) 組成。外層比內(nèi)層寬些，大概從70 nm

9、到200 nm 左右，主要由CotB、CotC、CotG和CotF等蛋白質(zhì) 組成。此外，還有一些重要的協(xié)調(diào)其他蛋白質(zhì)組 裝的形態(tài)建成蛋白質(zhì)，如Spo1VA、CotE、SpoVID和 SafA等。 2構(gòu)成芽孢衣的各種蛋白質(zhì) 21主要的形態(tài)建成蛋白質(zhì) (1)SpoIVA：當(dāng)編碼 SpoiVA的基因缺失，前芽孢衣(precoat)能形成， 但游離在母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中， 而不是包裹著前 芽孢，并且前芽孢的雙層膜當(dāng)中沒(méi)有皮層的形成。 對(duì)正常的芽孢進(jìn)行免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)SpoIVA在 前芽孢的表面構(gòu)成環(huán)， 與前芽孢的外膜直接相 連。其作用是將基質(zhì)層固定于前芽孢上，并參與 皮層的形成， 以及協(xié)調(diào) 芽孢衣和皮

10、層二者的形 成。(2)CotE：如缺失，則芽孢衣不能形成。用免 疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)定位于芽孢衣的內(nèi)外 層之間。在指導(dǎo)外層蛋白質(zhì)的組裝中起重要作用。 (3)SpoVID：SpoVID缺失如同SpoIVA缺失一樣， 能形成游離的芽孢衣，但不同的是皮層可以正常 的形成。說(shuō)明SpoD與SpoIVA一起參與基質(zhì)層 的固定，但前者不參與皮層的形成。 22 起輕度調(diào)節(jié)作用的形態(tài)建成蛋白質(zhì) (1) CotT：該基因缺失，則芽孢表現(xiàn)為在葡萄糖和果 糖為誘導(dǎo)物時(shí)出芽速度變慢，芽孢衣的內(nèi)層變 薄， 但抗性很正常。CotT 蛋白質(zhì)分子量為78 kD，由101 kD的前體切割而來(lái)，并且其C末端 無(wú)一例外是由酪氨酸和

11、甘氨酸組成的。(2)CotG： 該基因缺失對(duì)芽孢的抗性和出芽能力均無(wú)明顯影 響只是芽孢衣外層的形態(tài)非常的不正常。該蛋 白質(zhì)分子量為24 kD， 半數(shù)以上的氨基酸都帶正 電荷 (3)Corm：缺失可導(dǎo)致芽孢衣的外層組成蛋 白質(zhì)如CotC含量的顯著下降，并且芽孢衣的表面 不再光滑，而是出現(xiàn)一些突起。 23功能不明確的蛋白質(zhì) 主要指一些其基因被剔 除之后對(duì)芽孢無(wú)論是形態(tài)抗性還是出芽能力都 無(wú)顯著影響的蛋白質(zhì)， 如CotB、CotC。(1)CotC： 在芽孢衣中由CotC基因編碼的蛋白質(zhì)至少有四種 形式，在芽孢形成大概8 h左右出現(xiàn)兩種，分子量 分別為12 kD和21 kD2 h之后又出現(xiàn)兩種分子 量

12、分別為125 kD和30 kD的蛋白質(zhì)。后兩種是由 前兩種修飾的產(chǎn)物【l】。(2)CotB：該基因的編碼產(chǎn)物 應(yīng)是46 kD，但廣泛存在于芽孢衣中的是66 kD的 CotB蛋白質(zhì)，后者是由前者轉(zhuǎn)化來(lái)的【2。 3芽孢衣蛋白質(zhì)合成的基因調(diào)控與組裝的模型 芽孢衣的組成蛋白質(zhì)都是在母細(xì)胞中合成的， 接受o-E、SpoHID、盯x及GerE等母細(xì)胞中特殊的 盯因子或DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的調(diào)控。芽孢衣的組裝 人為的可以劃分為4步：(1)不對(duì)稱分裂完成，盯E 活化 由之轉(zhuǎn)錄出的SpoIVA和SpoVID結(jié)合到母 細(xì)胞的側(cè)隔膜上。二者形成一個(gè)球狀的外殼。Spo D定位依賴于Spo1VA而SpoIVA的定位則依 賴

13、于SpoVM。(2)前芽孢衣(precoat)的形成。Spo · 110 · 生命的化學(xué))2005年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) A指導(dǎo)cotE在距離由SpoIVA 和Spo1VD形成的 球狀外殼75 nm處形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。中間75 nm 的 空隙由多孔的基質(zhì)(matrix)組成，是其他內(nèi)層芽 孢衣蛋白質(zhì)組裝的位點(diǎn)。CotE 由E一0rE轉(zhuǎn)錄，并 受到SpoD的調(diào)控。(3)依賴于0rK的內(nèi)外層芽孢 衣的組裝。裹吞完成之后， 在E一0rK的轉(zhuǎn)錄作用 之下 一些內(nèi)層芽孢衣蛋白質(zhì)如CotD、CotH、 CotS和CotT等被合成并填充到75

14、nm的基質(zhì)中， 另一些構(gòu)成外層芽孢衣的蛋白質(zhì)如CotB、Cot C、 CotG和CotF等以依賴于CotE的方式在由CotE形 成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的外側(cè)進(jìn)行組裝。(4)由13" 和GerE 雙重調(diào)控的內(nèi)外層芽孢衣蛋白質(zhì)的組裝階段。例 如CotG指導(dǎo)CotB進(jìn)行組裝，以及一些組裝后修 飾。組裝模型圖解見(jiàn)圖131。在整個(gè)組裝過(guò)程中， 前兩步是在裹吞之前， 由盯因子0rE進(jìn)行轉(zhuǎn)錄， 部分蛋白質(zhì)受到SpoII1D 的調(diào)控， 而后兩步是在 裹吞完成之后，由0rK因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，部分蛋白 質(zhì)受到GerE的調(diào)控。在基因順序表達(dá)的過(guò)程中， 也存在著反饋抑制，如0rK對(duì)編碼0rE的基因的轉(zhuǎn) 錄起抑制作

15、用SpoII1 D對(duì)E一0rE轉(zhuǎn)錄的基因部分 起激活作用，部分起抑制作用，GerE抑制部分由 E一0rK轉(zhuǎn)錄的基因。與芽孢衣形成相關(guān)的蛋白質(zhì)的 基因除了CotB、CotG和CotH是緊密連鎖的之外 其他基因都是分散地存在于整個(gè)基因組當(dāng)中。 4芽孢衣蛋白質(zhì)合成后修飾 盡管芽孢衣蛋白質(zhì)的合成是受到基因調(diào)控的 但芽孢衣的正確組裝和定位還需依賴于特定蛋白 質(zhì)之間的聯(lián)系， 以及各種轉(zhuǎn)錄后修飾，包括交 聯(lián)、糖基化和蛋白質(zhì)酶水解等等。(1)交聯(lián)：構(gòu)成 芽孢衣的蛋白質(zhì)富含半胱氨酸和酪氨酸使芽孢 衣中存在著大量的二硫鍵及二酪氨酸之間形成的 鍵，增加了芽孢衣的強(qiáng)度。CotE具有過(guò)氧化物酶 活性，可以催化二酪氨酸交

16、聯(lián)， 該活性可能在 CotE指導(dǎo)外層芽孢衣蛋白質(zhì)組裝時(shí)起作用。由基 因糾編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的活性，可 以形成s一賴氨酸交聯(lián)。(2)糖基化： 由GerE調(diào)控 的cge和sps基因的編碼產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶芽 孢表面蛋白質(zhì)的糖基化與否可以決定芽孢的疏水 性和黏附能力。(3)蛋白質(zhì)酶的作用，至少一種 GerE依賴的與芽孢衣相連的蛋白質(zhì)水解酶已經(jīng)被 鑒定。除了上述幾種調(diào)節(jié)方式外，還有其他方 式， 例如：SarA基因編碼一個(gè)45 kD 的蛋白質(zhì)。 但還存在一種只具有SarA基因C末端編碼的大小 為30 kD 的蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)的N末端是由 Mini Reviews SarA基因第164個(gè)密碼子

17、編碼的甲硫氨酸。研究 表明，這兩種蛋白質(zhì)是由同一基因進(jìn)行選擇性剪 接造成的【4J。 5芽孢衣蛋白質(zhì)在表面展示技術(shù)中的應(yīng)用 表面展示技術(shù)用于生物吸附劑和生物催化劑 的開(kāi)發(fā)；抗菌素和抗原的鑒定；疫苗和藥物的靶 向定位等。該技術(shù)一般是通過(guò)將乘客蛋白質(zhì) (passenger protein)的基因與具有膜定位區(qū)的裝載 蛋白質(zhì)(carrier protein)基因進(jìn)行融合，表達(dá)出定 位于宿主表面的融合蛋白質(zhì)。目前應(yīng)用作為裝載 蛋白質(zhì)的芽孢衣蛋白質(zhì)主要是CotB和CotC。選擇 CotB是因?yàn)槠湟呀?jīng)確定定位于芽孢衣的外表面， 而CotC則是芽孢衣中較豐富的蛋白質(zhì)。并且二者 的缺 失不會(huì)影響到芽孢的正常形成

18、和正常的出芽。 利用CotB已經(jīng)成功地展示了破傷風(fēng)毒素的含459 個(gè)氨基酸殘基的C末端(1TrFC)ts。與其他的表面 展示系統(tǒng)相比，利用芽孢衣蛋白質(zhì)作為裝載蛋白 質(zhì)有很多優(yōu)點(diǎn)，其中最重要的是后者具有較高的 穩(wěn)定性。試驗(yàn)證明，新制備的與儲(chǔ)存l2周的 CotBTI'FC展示芽孢具有相似的抗原性t6。利用芽 孢作為表面展示系統(tǒng)的載體具有廣闊的前景。 目前對(duì)芽孢衣蛋白質(zhì)的研究主要是通過(guò)將化 學(xué)提取法和聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合對(duì)芽孢 衣蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離，再利用反遺傳技術(shù)(re verse genetics approach)獲取基因。或?qū)y(cè)序得到 的未知功能的基因，通過(guò)獲得缺失突變體來(lái)確 定該基因的功能。通過(guò)這些方法對(duì)芽孢衣蛋白質(zhì) 的組成以及組裝過(guò)程已經(jīng)有一定了解，但還有很 多待解決的問(wèn)題。如cotE是怎樣組織外層蛋白質(zhì) 進(jìn)行組裝的，芽孢衣蛋白質(zhì)什么區(qū)域的特點(diǎn)決定 了其是定位于內(nèi)膜還是外膜各種蛋白質(zhì)之間如 Cotja和Cotjc之間的關(guān)系等等。芽孢衣蛋白質(zhì)的 組裝過(guò)程如同E coli的T4噬菌體組裝過(guò)程一樣 已經(jīng)成為了解復(fù)雜形態(tài)發(fā)生過(guò)程中自我組裝的研 究模型。對(duì)芽孢衣的研究無(wú)論從理論上還是實(shí)際 的應(yīng)用都具有重要的意義。 參 考 文 獻(xiàn) 【1 I