生物制藥技術(shù)復(fù)習(xí)題

1、-作者xxxx-日期xxxx生物制藥技術(shù)復(fù)習(xí)題【精品文檔】名詞解釋1、生物技術(shù)制藥：是指利用生物系統(tǒng)或通過生物反應(yīng)過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。2、生物藥物：是指以生物資源為原料或以生物技術(shù)為手段開發(fā)生產(chǎn)的用作疾病的預(yù)防、診斷和治療的醫(yī)藥品。2.5、限制酶：及其特性限制性核酸內(nèi)切酶，是一類專一性很強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶，專一地識別和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切斷DNA雙鏈。3、連接酶：能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連接酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)和分離純化，使兩個(gè)DNA片段在體外連接形成重組DNA分子成為可能。 4、限制酶星活性：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有嚴(yán)格的識別序列。在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，會導(dǎo)致限制酶識別序列

2、的特異性發(fā)生改變，在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，稱限制酶的第2活性或星活性。5、基因載體：在細(xì)胞內(nèi)具有能進(jìn)行自我復(fù)制的獨(dú)立DNA分子作為外源DNA片段的運(yùn)載體，簡稱基因載體，又稱分子克隆載體或無性繁殖載體。6、粘粒：是一種有噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由DNA的cos區(qū)段與質(zhì)粒DNA重組構(gòu)建而成。7、基因文庫：將供體生物的DNA用限制酶切成許多片段，在連接酶的作用下分別與克隆載體進(jìn)行體外重組，這種含有供體生物全部不同基因的重組克隆載體的總體稱供體生物的基因文庫。 8、cDNA基因文庫：以供體生物的總mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成核苷酸序列互補(bǔ)的DNA（cDNA），將全部cDNA分別與克隆載體進(jìn)行

3、體外重組，這些含有供體生物全部不同基因的重組克隆載體的總體稱供體生物的cDNA基因文庫。 9、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerose chain reaction）技術(shù)，簡稱PCR技術(shù)，是一種用于在體外擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的分子生物學(xué)技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可在很短的時(shí)間內(nèi)得到數(shù)百萬個(gè)特異DNA序列的拷貝。10、轉(zhuǎn)化：將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。11、轉(zhuǎn)染：將重組噬菌體DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。12、感染：將重組噬菌體DNA包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。 13、多克隆位點(diǎn)：基因載體上由多種限制酶單一識別序列

4、組成的序列，是插入外源目的基因DNA片段的位點(diǎn)。14、高豐度mRNA：從某些特定型分化細(xì)胞分離的細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目的mRNA占總mRNA的5090%。稱為高豐度mRNA。15、抗體：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。 16、單克隆抗體：采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，由純一的單克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的，針對一個(gè)抗原決定簇的，結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體稱單克隆抗體。 17、第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成的復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合的抗體，又稱抗抗體。 18、克隆化：分離獲得單細(xì)胞并將單細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)過程。這些細(xì)胞集團(tuán)中的每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能是完全

5、相同的。19、細(xì)胞分化：生物細(xì)胞隨功能不同所產(chǎn)生的形態(tài)變化稱分化。20、懸浮培養(yǎng)：利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)生物細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長增殖的過程。21、貼壁培養(yǎng)：使細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。22、愈傷組織培養(yǎng)：從植物各種器官的外植體增殖而形成愈傷組織的培養(yǎng)。23、外植體：指用于植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)的器官或組織，如根、莖、葉、花、果、胚乳、胚珠、花粉等。24、繼代培養(yǎng)：由最初的外植體上切下的新增殖的組織或細(xì)胞，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)即為“繼代培養(yǎng)”。25、植物生長調(diào)節(jié)劑：指對植物的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，既包括人工合成的，也包括一些天然的化合物以及植物激素。26

6、、植物激素：僅指植物天然產(chǎn)生的對植物的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。簡答題1、限制酶有哪些特性？（1）不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）。（2）各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu)。（3）各種限制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種粘性或平整末端。（4）在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有嚴(yán)格的識別序列。在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，會導(dǎo)致限制酶識別序列的特異性發(fā)生改變，在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，稱限制酶的第2活性或星活性。2、Taq DNA聚合酶的用途？該酶可用于對DNA進(jìn)行測序，但主要用于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），對DNA分子的特定序列（目的基因）進(jìn)行體外擴(kuò)增。3、基因載體有哪

7、些特性？要有復(fù)制子（Replicom）功能，且復(fù)制起始區(qū)中沒有限制酶的酶切位點(diǎn)。要含有強(qiáng)啟動子，要有能促進(jìn)外源DNA高水平表達(dá)的調(diào)控區(qū)。要有多種限制酶的單一切點(diǎn)，以適用于多種限制酶產(chǎn)生的DNA片段的插入。具有兩種以上易被檢測的選擇性遺傳標(biāo)記，作為對重組與非重組轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。載體DNA的分子量要盡可能小，以利于容納較長區(qū)段的外源DNA片段。應(yīng)屬于松弛型復(fù)制，能在氯霉素存在下擴(kuò)增其拷貝數(shù)。從安全防治考慮，載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。4、如何將天然的原始載體改造成理想的基因載體？引入強(qiáng)啟動子。引入選擇性標(biāo)記基因。切除大部分多余序列段，以提高容納外源DNA片段的能力。

8、引入由多種限制酶單一識別序列組成的多克隆位點(diǎn)。引入多種用途的輔助序列。5、簡述cDNA基因文庫構(gòu)建的基本步驟。從供體生物細(xì)胞或組織中提取純化得總RNA。從總RNA中分離純化出總mRNA。以總mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA?？俢DNA分別克隆到載體上構(gòu)建DNA重組體。cDNA文庫的鑒定。含目的基因cDNA重組體的篩選6、 PCR技術(shù)的基本程序變性：首先使雙鏈DNA在反應(yīng)液中經(jīng)熱變性（9495）而分開成單鏈（或使反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA:RNA雜交鏈分開成單鏈）。退火：然后降溫至4060，在低溫下與兩個(gè)引物進(jìn)行退火，使引物與單鏈DNA配對結(jié)合。 延伸：再在中溫72下利用Taq DNA聚合酶的聚合

9、活性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行聚合（延伸）反應(yīng)。7、簡述RT-PCR技術(shù)合成目的基因的基本 步驟。 從供體生物特定分化型組織或細(xì)胞中提取純化總RNA，其中目的mRNA為高豐度mRNA。 以O(shè)ligo(dT)為引物，以總RNA中的總mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)的總cDNA。 變性：升溫至9495加熱5min，使總mRNA cDNA的雜交鏈由于熱變性而分開成單鏈。 退火：降溫至4060，加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷酸引物，進(jìn)行退火，使引物與單鏈mRNA和cDNA結(jié)合。 引物應(yīng)是與目的基因3端互補(bǔ)的核苷酸序列延伸：升至中溫72，在反應(yīng)體系中（擴(kuò)增緩沖液）加入Taq 聚合酶和四種dNTP，

10、分別以目的mRNA和目的cDNA單鏈為模板進(jìn)行聚合（延伸）反應(yīng)。如此按變性、退火、延伸進(jìn)行約30次重復(fù)循環(huán)，得到目的cDNA大量拷貝（10 6倍）。從反應(yīng)液中分離提取出雙鏈目的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。目的cDNA與載體DNA進(jìn)行體外重組，構(gòu)建重組克隆載體。帶有目的cDNA的重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞。8、目的基因DNA與載體DNA體外重組的定向克隆法和粘性末端連接法各有何特點(diǎn)？如何克服酶切后同一DNA片段自身環(huán)化？（1）定向克隆法：當(dāng)用兩種不同的限制酶（如用BamH和Hind）消化同一DNA基因組時(shí)，切下來的同一DNA片段帶有非互補(bǔ)的突出末端，這樣供體DNA片段只能以一個(gè)方向很容易地連接到同樣用Bam

11、H和Hind進(jìn)行消化而產(chǎn)生相匹配粘性末端的載體DNA當(dāng)中。特點(diǎn)：該法的優(yōu)點(diǎn)是由于載體DNA片段兩突出末端不互補(bǔ)，不能自身環(huán)化，但與目的基因DNA片段定向重組率卻較高。（2）粘性末端連接法：用一種限制酶酶切，會產(chǎn)生帶有相同粘性末端的外源目的DNA片段，必須與用同一種限制酶消化而形成具有相同匹配末端的質(zhì)粒載體相連接。特點(diǎn)：質(zhì)粒載體DNA和外源DNA片段都可能發(fā)生自身環(huán)化，也有可能形成串聯(lián)寡聚物。（3）用堿性磷酸酶去除載體DNA兩端的5磷酸基團(tuán)以盡量減少載體DNA的自身環(huán)化或連接。經(jīng)去磷酸化的載體DNA仍然可有效地與具有5末端磷酸的外源DNA相連接。9、理想受體細(xì)胞應(yīng)具有哪些特性？具有接受外源DNA

12、的能力，能發(fā)展成感受態(tài)細(xì)胞。應(yīng)為限制酶和修飾系統(tǒng)缺陷型，即外源DNA導(dǎo)入后不致被降解或修飾。其遺傳型應(yīng)是抗重組（rec A-）的，以保持外源DNA在受體細(xì)胞中的完整性。不適于在人體內(nèi)或非培養(yǎng)條件下生存。重組體DNA不易轉(zhuǎn)移，只在受體細(xì)胞中復(fù)制。10、抗生素抗性基因失活法篩選含目的基因工程細(xì)胞株的原理和方法。很多質(zhì)粒載體都帶有1個(gè)或多個(gè)抗生素抗性基因標(biāo)記，在這些抗藥基因內(nèi)有限制酶的識別位點(diǎn)。當(dāng)用某種限制酶消化并在此位點(diǎn)插入外源目的DNA時(shí)，抗藥基因不再表達(dá)，稱為抗性基因插入失活。當(dāng)插入外源目的DNA的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在藥物選擇性平板培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)對該藥物由抗性轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾校憧珊Y選出重組轉(zhuǎn)化子

13、。 先用含Amp的選擇性平板培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，淘汰大部分非轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。將所有長出的單菌落編號后分別接種于含Tet的選擇性培養(yǎng)基上，在此培養(yǎng)基上不能生長的菌落，即為外源基因插入Tetr基因的BamH酶切位點(diǎn)的重組菌株，長出的為含有非重組質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞株11、-半乳糖苷酶插入失活法篩選含目的基因工程細(xì)胞株的原理和方法。許多質(zhì)粒載體（如PUC系列）都帶有一個(gè)來自大腸桿菌的Lac操縱子的部分DNA區(qū)段（ Lac Z和調(diào)控序列Lac R），這一區(qū)段編碼-半乳糖苷酶N端的一個(gè)片段（但無酶活力）。宿主細(xì)胞可編碼-半乳糖苷酶C端的部分片段（也無酶活力），但兩者之間可通過基因互補(bǔ)（稱互補(bǔ)），從而融為一體形

14、成具有酶活力的-半乳糖苷酶。由互補(bǔ)而產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌在有誘導(dǎo)物異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA片段插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)后，Lac Z片段失活，破壞了互補(bǔ)作用。因此，帶有外源目的DNA重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落，從而僅通過目測就可識別并篩選出帶有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落。12、用于制備雜交瘤細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備哪些特性（簡答題）？ 不能產(chǎn)生自身免疫球蛋白為避免雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體不純，骨髓瘤細(xì)胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。應(yīng)為HGPRT缺陷的細(xì)胞系其細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補(bǔ)救途徑必

15、須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即HGPRT陰性細(xì)胞。3.合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定。13、雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)的原理？選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑。骨髓瘤細(xì)胞因是HGPRT缺失型，無DNA合成的補(bǔ)償途徑，因此瘤細(xì)胞和瘤-瘤融合細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。而B細(xì)胞和B-B融合細(xì)胞在這樣的離體培養(yǎng)條件下，無法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但B細(xì)胞中有這種酶，因此B-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞含有HGPRT酶

16、，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長。 14、貼壁依賴型動物細(xì)胞離體培養(yǎng)有哪些形態(tài)類型，與其來源有何關(guān)系？ 貼壁依賴型動物細(xì)胞離體培養(yǎng)形態(tài)類型有： 纖維樣細(xì)胞型 貼壁培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則的三角形，細(xì)胞群常連接成網(wǎng)，生長時(shí)呈放射狀、漩渦狀或火焰狀。 主要來源于中胚層組織的細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或成骨細(xì)胞等）。 上皮樣細(xì)胞型 貼壁培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則的多角形，生長時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。 主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，如皮膚、腸管和肺泡上皮細(xì)胞等。15、簡述動物細(xì)胞的生理特點(diǎn)。 （1）細(xì)胞分裂周期長：動物細(xì)胞分裂所需時(shí)間一般為12

17、48h。 （2）離體培養(yǎng)常需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。 （3）正常二倍體細(xì)胞生長壽命是有限的。 （4）動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感，對多種物理化學(xué)因素的變化耐受力很弱。 （5）對培養(yǎng)基要求高。（6）蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。16、簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件。 （1）水質(zhì) ：培養(yǎng)液用水必須經(jīng)嚴(yán)格處理，使水中金屬離子降至最低，電阻值必須大于18M。 （2）溫度 ：哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37+0.5，而昆蟲細(xì)胞則為27左右。 （3）滲透壓 ：由于無細(xì)胞壁，對培養(yǎng)液滲透壓極敏感，通常最理想的滲透壓為290300mOsm/kg。細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。細(xì)胞· h或24mg/106細(xì)胞&

18、#183;d。在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液的體積不超過瓶總?cè)莘e的30%，通過液面的空氣交換就可保證有足夠的氧。17、動物細(xì)胞離體培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基除基本成分外，還需添加哪些特殊成分？ （1）激素和生長因子：有胰島素、甲狀腺素、生育酚、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等。 （2）結(jié)合蛋白、血蛋白和鐵傳遞蛋白等。 （3）貼附伸展因子：纖維結(jié)合蛋白、軟骨素、膠原和昆布氨酸等。 （4）其它因子和元素：谷胱甘肽，鋅、鈷、鉬、硒等。18、動物細(xì)胞離體培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)方法？各有何特點(diǎn)？ （1）懸浮培養(yǎng) 使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長增殖的過程。 特點(diǎn)：操作簡便，培養(yǎng)條件較均一。 傳質(zhì)和傳氧效果好，容易擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)。 較難采

19、用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度較低。 （2）貼壁培養(yǎng) 使細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。 特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是適用的細(xì)胞種類廣，較易采用灌流連續(xù)培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度。 缺點(diǎn)是操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的貼附面積。 培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。壁培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的另一個(gè)不同之處在于傳代或放大培養(yǎng)時(shí)，常需要用酶將細(xì)胞從基質(zhì)上消化下來。19、植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本程序 。 （1）由完整的植株制取所需的外植體（組織、器官或細(xì)胞） （2）進(jìn)行植物外植體培養(yǎng)或誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行脫分化細(xì)胞的培養(yǎng)，建立穩(wěn)定高產(chǎn)的細(xì)胞株系。 （3）進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)或液體懸浮大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。20、植物細(xì)胞培養(yǎng)的生理特點(diǎn)。 （1）培養(yǎng)過程中細(xì)胞重量的增加主要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的累積則主要在穩(wěn)定期完成。 （2）很少以單一細(xì)胞懸浮生長，而多以非均相集合體的細(xì)胞團(tuán)形式存在。 （3）隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長（對數(shù)生長后期），細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)上升，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，細(xì)胞密度高，培養(yǎng)基粘度大，易產(chǎn)生混合和循環(huán)不良的問題。 （4）其纖維素的細(xì)胞壁使得其外骨架相當(dāng)脆弱，抗張力強(qiáng)度大，抗剪切能力