抗菌肽的作用機(jī)制及其抗病毒活性

1、抗菌肽的作用機(jī)制及其抗病毒抗菌肽的作用機(jī)制及其抗病毒活性活性抗菌肽的作用機(jī)制及其抗病毒活性1、什么是抗菌肽2、 抗菌肽的來源3、抗菌肽的結(jié)構(gòu)4、抗菌肽的作用機(jī)制5、抗菌肽的抗病毒活性6、抗菌肽對病毒的效價(jià)和副作用1 1、什么是抗菌肽、什么是抗菌肽抗菌肽（amps）是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)，它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。由于抗菌肽對細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細(xì)胞等有著廣泛的抑制作用，并且隨著越來越多的抗生素耐藥微生物的出現(xiàn)，使得抗菌肽在醫(yī)藥行業(yè)和食品添加劑等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。本文綜合近年來抗菌肽的研究，概述了抗菌肽的來源、功能、作用機(jī)制和應(yīng)用前景。 20世紀(jì)80

2、年代，由瑞典科學(xué)家boman研究小組用蠟狀芽孢桿菌(bacillus cereus)誘導(dǎo)惜古比天蠶(hyalophora cecropia)后產(chǎn)生了抗菌多肽類物質(zhì)，隨后發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)抗菌肽天蠶素(cecropins)。人們最初把這類具有抗菌活性的多肽稱為“antibacterial peptides”,原意為“抗細(xì)菌肽”；后來發(fā)現(xiàn)其有抗真菌等微生物的作用，便改稱為“antimicrobial peptides”,意為“抗微生物肽”。 抗菌肽是由基因編碼在核糖體內(nèi)合成的多肽，不同種類的抗菌肽通常有共同的特點(diǎn)：短肽(3060個(gè)氨基酸),強(qiáng)陽離子性(等電點(diǎn)范圍為8.910.7),熱穩(wěn)定性好(100 ,

3、15 min)，分子質(zhì)量約為4 ku，無藥物屏蔽且不影響真核細(xì)胞。當(dāng)今，抗菌肽已經(jīng)可以由原核生物到人類的大部分有機(jī)生物體中成功分離和分類。抗菌肽通常作用于細(xì)菌，在真核生物的天然免疫方面發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是古代進(jìn)化中哺乳動(dòng)物體內(nèi)有效保留的免疫分子。2 2、抗菌肽的來源抗菌肽的來源抗菌肽根據(jù)其來源的不同通?？梢苑譃?大類，分別為來源于昆蟲、動(dòng)物、微生物基因工程菌的抗菌肽以及人工合成的抗菌肽。迄今為止，已有1 500多種不同來源的抗菌肽被相繼報(bào)道。2 2.1 .1 來源于昆蟲的抗菌肽來源于昆蟲的抗菌肽1.cecropins：cecropins是在天蠶蛹的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的，它是世界上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗

4、菌肽。2. 防御素：防御素有富含半胱氨酸的陽離子結(jié)構(gòu)，是具有3個(gè)或者4個(gè)二硫鍵的獨(dú)特結(jié)構(gòu)的多肽。防御素已從哺乳動(dòng)物、昆蟲和植物中分離出來，它們作為先天免疫效應(yīng)分子，對病原體感染提供了最初的有效防御。 3. 富含甘氨酸的抗菌肽：迄今為止，許多抗菌肽已經(jīng)在不同的昆蟲中被證實(shí)，如：肌毒素(creatoxin)、attacins、雙翅殺菌肽(diptericins)和鞘翅殺菌肽(coleoptericins)等。這些抗菌肽都富含14%22%的甘氨酸殘基，并且這些殘基對肽鏈的三級結(jié)構(gòu)有重要影響。富含甘氨酸的抗菌肽家族通?？梢钥拐婢透锾m氏陰性細(xì)菌，以及通過破壞細(xì)胞膜來抗癌細(xì)胞。 4.富含脯氨酸的抗菌肽：

5、富含脯氨酸的抗菌肽是從哺乳動(dòng)物和昆蟲體中分離出來的，主要是抗革蘭氏陰性細(xì)菌，包括某些植物半生細(xì)菌和一些人類病原體。2.2 2.2 來源于動(dòng)物的抗菌肽來源于動(dòng)物的抗菌肽抗菌肽起初是在無脊椎動(dòng)物動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的，隨后在脊椎動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)，這些肽顯示出多樣的序列結(jié)構(gòu)和特異性的靶標(biāo)。基因編碼的抗菌肽能夠在哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類、昆蟲等多種不同生物體的組織中表達(dá)。2.3 2.3 來源于微生物工程菌的抗菌肽來源于微生物工程菌的抗菌肽由于長期使用抗生素導(dǎo)致耐藥性菌株增多，人類需要尋找一種新型的抗菌劑?？咕挠兄鴱V譜抗菌活性，能快速殺死作用靶標(biāo)，它最有希望成為傳統(tǒng)抗菌素的替代品。但是實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用抗菌肽還有一定

6、的問題，最主要是昂貴的生產(chǎn)成本限制了抗菌肽的應(yīng)用。利用基因工程重組技術(shù)異源表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)抗菌肽是一種新模式。其中，大腸桿菌是生產(chǎn)抗菌肽良好的表達(dá)系統(tǒng)，但是這種小肽很難在這種高水平工程菌株中表達(dá)，特別是遇到毒肽類時(shí)，會對宿主菌有殺傷作用。最近有人開發(fā)利用甲基畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來大規(guī)模表達(dá)不同來源的蛋白質(zhì)，有良好的表達(dá)效果。2.4 2.4 來源于人工合成的抗菌肽來源于人工合成的抗菌肽近年來，隨著人們對抗菌肽研究的深入，科研人員嘗試人工合成抗菌肽，并在醫(yī)療應(yīng)用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的藥物已進(jìn)入市場，如：美國馬蓋寧制藥公司研發(fā)出來的馬蓋寧(magainin)藥物可殺死病毒和腫瘤細(xì)胞，柞蠶抗

7、菌肽能抑制乙型肝炎和殺滅腫瘤細(xì)胞，在醫(yī)藥上已制成腎肝寧膠囊治療腎炎及肝炎等。3 3、抗菌肽的結(jié)構(gòu)、抗菌肽的結(jié)構(gòu)抗菌肽依其結(jié)構(gòu)可分為多種類型，其中cathelicidin和defensin為主要的類型；可將其分為5類：(1)單鏈無半胱氨酸殘基的-螺旋，或由無規(guī)卷曲連接的兩段-螺旋組成的肽；(2)富含某些氨基酸殘基但不含半胱氨酸殘基的抗菌肽；(3)含1個(gè)二硫鍵的抗菌多肽； (4)有2個(gè)或2個(gè)以上二硫鍵、具有-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽；(5)由其它已知功能的較大的多肽衍生而來的具有抗菌活性的肽。其中最早分離到的cecropins和從非洲爪蟾中分離到的magainins等屬于第一類抗菌肽，通常也將其稱為cec

8、ropin類抗菌肽，目前對此類抗菌肽的研究也較深入。4 4、抗菌肽的作用機(jī)制、抗菌肽的作用機(jī)制抗菌肽的確切作用機(jī)制目前還在深入研究中，研究人員提出多種理論假設(shè)來解釋抗菌肽抑制或殺滅微生物的過程。但是抗菌肽的抗菌機(jī)制研究只針對個(gè)別幾種抗菌肽，所以目前還沒有一個(gè)能夠涵蓋所有種類抗菌肽作用機(jī)理的假說，且不確定哪種假說更接近真實(shí)情況。4 4.1 .1 抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用抗菌肽能夠與細(xì)胞膜表面相互作用，使膜的通透性改變。陽離子抗菌肽的正電荷區(qū)域與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷區(qū)域相互作用，使抗菌肽分子的疏水端插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜中，進(jìn)而改變脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)?？咕呐c細(xì)胞膜作用后形成跨膜電位，打破

9、酸堿平衡，影響滲透壓平衡，抑制呼吸作用，總之抗菌肽與膜的相互作用直接關(guān)系到抗菌肽的抗菌活性。 如圖所示，目前，常用的至少有4個(gè)模型來描述抗菌肽的作用機(jī)制。a為聚集體模型(aggregate channel)，即抗菌肽與細(xì)胞膜上的磷脂分子結(jié)合成復(fù)合物，一旦復(fù)合物崩潰，抗菌肽就進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜也因受到彎曲張力導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 b為環(huán)孔模型(toroidal)，認(rèn)為聚集的抗菌肽分子是垂直嵌入到細(xì)胞膜上，其疏水區(qū)的位移可以使細(xì)胞膜疏水中心形成裂口，引發(fā)磷脂單分子層向內(nèi)彎曲，形成一個(gè)直徑為12 nm的環(huán)孔。 c為桶板模型(barrel-stave)，有研究人員指出結(jié)合于細(xì)胞膜表面的抗菌肽相互聚集，以多

10、聚體的形式插入細(xì)胞膜雙分子層中，因而形成一個(gè)跨膜離子通道。離子通道的形成使外界的水分子和離子等可以滲入到細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞質(zhì)也可以外流。嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞膜會崩裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 d為地毯模型(carpet-like)，抗菌肽先是平行排列在細(xì)胞膜上，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就像地毯一樣覆蓋在膜表面，以“去垢劑”的作用方式破壞細(xì)胞膜而引起細(xì)胞死亡。此模型中，地毯模型無需抗菌肽的特殊結(jié)構(gòu)，也無需形成孔道，但抗菌肽的正電荷需要分布于多肽全長，且在整個(gè)過程中抗菌肽始終與脂質(zhì)頭端作用而無多肽垂直重排過程。4.2 4.2 抗菌肽干擾靶標(biāo)的能力抗菌肽干擾靶標(biāo)的能力抗菌肽除了作用于細(xì)胞膜，還可以作用于細(xì)胞內(nèi)的其他靶標(biāo)。抗菌肽在

11、進(jìn)入細(xì)胞之后，通過與細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的特異性結(jié)合干擾細(xì)胞代謝，達(dá)到抑制和殺滅細(xì)菌的目的。此理論解釋了許多抗菌肽在非常低的濃度下仍然能夠?qū)е录?xì)菌死亡的現(xiàn)象。 抗菌肽主要通過以下幾個(gè)方面在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用：1)與細(xì)胞內(nèi)的酸性物質(zhì)結(jié)合，阻斷dna復(fù)制和rna合成；2)影響蛋白質(zhì)的合成；3)抑制細(xì)胞壁的合成，阻礙細(xì)胞分裂；4)抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性等。5 5、抗菌肽的抗病毒活性、抗菌肽的抗病毒活性抗菌肽作為一種結(jié)構(gòu)簡單但功能多樣、廣譜抗菌、抗病毒的分子,其作用機(jī)制也十分復(fù)雜,同一種分子可能有多種機(jī)制,但抗菌肽的抗病毒機(jī)制目前尚不清楚。多數(shù)抗菌肽對包膜病毒的滅活作用高于無包膜病毒,這似乎提示抗菌肽通過作用于病毒外殼和

12、核殼體之間的磷脂被膜來影響其活性。 抗菌肽對磷脂被膜的影響在細(xì)菌上取得了一定進(jìn)展,殺菌肽a結(jié)合到大腸桿菌(escherichiacoli)膜上以后,在電子顯微鏡下可以觀察到殺菌肽a在大腸桿菌的膜上形成一個(gè)直徑9.6 nm的病灶和直徑4.2 nm的孔洞,并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流。但各種包膜病毒對抗菌肽hnp-1的敏感性相差1 000倍,似乎又說明抗菌肽的作用不完全取決于病毒的包膜。 另外,病毒包膜來自于宿主細(xì)胞的質(zhì)膜,而宿主(真核生物)的質(zhì)膜對抗菌肽具有很強(qiáng)的抵抗力,病毒對抗菌肽的敏感性可能是因?yàn)椴《景ど洗嬖诘牟《镜鞍谆蛲庠葱粤字＝z氨酸改變了其性質(zhì),同時(shí)也不能排除抗菌肽與病毒外殼蛋白的直接作用。

13、 此外,在對dermaseptin s4、defensins和apolipopro-teins的研究表明,抗菌肽對病毒的作用發(fā)生在病毒粒子與宿主細(xì)胞融合之前,可能是由于抗菌肽與病毒細(xì)胞表面的磷脂結(jié)合,從而阻止病毒粒子與宿主細(xì)胞的融合。另一種推測是抗菌肽與病毒表面起接觸融合作用的糖蛋白或宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素葡糖胺聚糖(hs)結(jié)合,從而阻止病毒粒子與宿主細(xì)胞的融合。 抗菌肽抑制病毒的另一種可能機(jī)制是抑制病毒基因的表達(dá)。wachinger等用hiv-1體外感染t細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,然后用蜂毒素在亞毒性濃度下處理細(xì)胞,結(jié)果顯示,hiv-1的基因mrna和hiv長末端重復(fù)序列(hiv ltr)的轉(zhuǎn)錄

14、活性被抑制。表明這類抗菌肽不是通過降解細(xì)胞質(zhì)膜或病毒被膜來顯示抗病毒活性的。 蜂毒素和天蠶素僅降低hiv基因表達(dá)水平,而不影響宿主細(xì)胞的看家基因pbgd的表達(dá)以及sv40早期啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。這表明蜂毒素可以選擇性地抑制hiv基因的表達(dá)。作為膜活性肽,蜂毒素可以通過多種渠道影響細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,如激活磷脂酶a2、降低鈣調(diào)蛋白和蛋白激酶c的活性,進(jìn)而改變hiv轉(zhuǎn)錄刺激因子的活性和平衡,或引發(fā)類似干擾素對hiv的抑制機(jī)制。 另外,蜂毒素還可能參與hiv基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,因?yàn)樵趙achinger等4的試驗(yàn)中,較大和中等分子mrna的量遠(yuǎn)小于小分子mrna的量。抗菌肽還可能通過模擬病毒的侵染過程發(fā)

15、揮作用,如蜂毒素及其類似物的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列有較高的相似性,而這部分序列在病毒顆粒組裝中與rna和蛋白質(zhì)結(jié)合密切相關(guān),這使得蜂毒蛋白分子可以與病毒包被蛋白在與rna結(jié)合過程中競爭,導(dǎo)致與其結(jié)合的rna構(gòu)象的改變,從而不能與正常蛋白質(zhì)結(jié)合,病毒顆粒無法正常組裝。6 6、抗菌肽對病毒的效價(jià)和副作用、抗菌肽對病毒的效價(jià)和副作用抗菌肽的功能是多方面的,在我們所需的功能方面不一定有最理想的效價(jià),還可能有細(xì)胞毒性等副作用,這需要對分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椧蕴岣咂湫r(jià)、降低或消除副作用。蜂毒素有2個(gè)規(guī)則的雙螺旋,分別由211殘基和1326殘基組成。殘基11、12將2個(gè)螺旋交聯(lián)在一起。 如果用能加強(qiáng)雙螺旋功能的氨基酸取代原有氨基酸,如用ala取代pro,肽的活性則被加強(qiáng)了。如果組成雙螺旋區(qū)域的殘基缺失,它的