第4章 蛋白質穩(wěn)定性和穩(wěn)定化

1、第四章第四章 蛋白質的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化蛋白質的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化生命科學學院: 柯德森DQQ270820679研究意義研究意義: 了解蛋白質穩(wěn)定性與結構的關系是理解蛋白質分子自我裝配過程的關鍵.研究蛋白質穩(wěn)定性機制是實現(xiàn)酶工程研究目標的重要基礎.第一節(jié)第一節(jié): 蛋白質的穩(wěn)定性蛋白質的穩(wěn)定性一一. 蛋白質穩(wěn)定性的分子原因蛋白質穩(wěn)定性的分子原因蛋白質的穩(wěn)定性蛋白質的穩(wěn)定性: 蛋白質抵抗各種因素的影響,保持其生物活力的能力.蛋白質的特定功能是由其特定的空間結構決定的,要保持其生物活力,必須保持其空間結構,穩(wěn)定蛋白質空間結構的因素是什么?理解蛋白質理解蛋白質穩(wěn)定性的概念穩(wěn)定性的概念?維持蛋白結構穩(wěn)定的主要因

2、素維持蛋白結構穩(wěn)定的主要因素:金屬離子、底物、輔因子和其他相對低分子質量配體的結合作用蛋白質-蛋白質和蛋白質-脂的作用鹽橋和氫鍵二硫鍵對氧化修飾敏感的氨基酸含量較低氨基酸殘基的堅實裝配疏水相互作用(思考題)疏水性標尺疏水性標尺疏水性氨基酸越多越穩(wěn)定疏水性氨基酸越多越穩(wěn)定?疏水性與蛋白質穩(wěn)定性的關系小結 疏水性大小與穩(wěn)定性沒有必然的聯(lián)系 非極性氨基酸在蛋白質球體內的規(guī)則的排列是穩(wěn)定性的原因之一 增加疏水作用是穩(wěn)定蛋白質的實用方法:降低蛋白質表面的疏水性,增加蛋白質內部的疏水性二二. 測定蛋白質穩(wěn)定性的方法測定蛋白質穩(wěn)定性的方法l比較蛋白質穩(wěn)定性的準則包括比較蛋白質穩(wěn)定性的準則包括:熔化溫度Tm;

3、蛋白質伸展一半時的變性劑濃度蛋白質自由能;最大穩(wěn)定性溫度(Ts);在特定溫度下蛋白質功能活性維持時間.思考思考l熔化溫度Tm和蛋白質伸展50%時的變性劑濃度是預測酶穩(wěn)定性的最有用參數(shù);Tm: 蛋白質受熱伸展過渡中點時的溫度;變性劑濃度變性劑濃度: 蛋白質加變性劑伸展過程中使蛋白質伸展一半時所需要的變性劑濃度;蛋白質失活的原因和機理蛋白質失活的原因和機理蛋白質水解酶和自溶作用蛋白質水解酶和自溶作用聚合作用聚合作用:蛋白質首先發(fā)生可逆性伸展蛋白質首先發(fā)生可逆性伸展,伸展的蛋伸展的蛋白質分子彼此締合白質分子彼此締合,以最大限度減少疏以最大限度減少疏水氨基酸暴露于水溶劑水氨基酸暴露于水溶劑,最后可能發(fā)

4、生最后可能發(fā)生蛋白質蛋白質分子間二硫鍵分子間二硫鍵的形成的形成,從而使蛋從而使蛋白質沉淀析出白質沉淀析出.蛋白質的聚合作用可能蛋白質的聚合作用可能是不可逆的是不可逆的,并不一定是不可逆的并不一定是不可逆的.思考聚合如果發(fā)生共價鍵就是不可逆的聚合如果發(fā)生共價鍵就是不可逆的?極端極端pH:活性中心氨基酸必需基團電離.pH的變化可以引起蛋白質的伸展,這個過程原則上是可逆的,但這些變化常能導致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.氧化作用氧化作用:各種氧化劑能氧化帶芳香族側鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。分子氧、H2O2和氧自由基是常見的蛋白質氧化劑。表面活性劑和去污劑表面活性劑和去污劑

5、表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質發(fā)生強烈表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質發(fā)生強烈的相互作用的相互作用,導致蛋白質不可逆變性導致蛋白質不可逆變性.其中陰離其中陰離子去污劑的作用比陽離子和非離子去污劑強烈子去污劑的作用比陽離子和非離子去污劑強烈.變性劑：變性劑：脲和鹽酸胍:機制尚不明確,可能是消除了維持三級結構的疏水作用力或直接與蛋白質分子作用.高濃度鹽：高濃度鹽既有穩(wěn)定作用也有變性作用，這要看鹽的性質和濃度。螯合：常常不可逆地失活需要金屬輔因子的酶，但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子的酶；有機溶劑：改變溶液的介電常數(shù);增加疏水核的溶解度,降低帶電表面的溶解度;奪去酶分子表面的必需水而使酶失活.重金屬離子和

6、巰基試劑重金屬離子和巰基試劑:與蛋白質的巰基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應。熱熱:熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常遇到的酶失活的原因.熱失活也分二步過程:伸展-不可逆失活.機械力：機械力：振動、剪切、超聲波、壓力都可能引起蛋白質的變性，這種變性理論上是可逆的，但也可能伴隨著其他反應而不可逆地失活。冷凍和脫水：冷凍和脫水：冷凍和脫水時，溶質被濃縮，引起酶微環(huán)境中pH和離子強度的劇烈改變，減弱疏水相互作用,并可能引起二硫交換和巰基的氧化。輻射作用輻射作用:輻射可產(chǎn)生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或間接地作用于蛋白質分子.第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質的穩(wěn)定化蛋白質的穩(wěn)定化 一是如何防止蛋白質的可逆伸展，

7、可以開發(fā)出普遍適用的方法； 二是一旦酶發(fā)生了可逆伸展，如何防止其不可逆失活反應的發(fā)生，對此針對不同的失活原因采取不同的特殊穩(wěn)定化方法。一一. 固定化：固定化：固定化穩(wěn)定酶的因素：固定化穩(wěn)定酶的因素：空間障礙、機械方式的空間限制。空間障礙：空間障礙：由于空間障礙可以防止蛋白水解酶的作用，阻擋酶與化學失活劑的接觸，同時阻礙氧向酶的擴散可以保護對氧不穩(wěn)定的酶。機械方式機械方式: 使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密的孔中可以使酶的構象更加堅牢，從而阻止酶構象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡?？臻g限制引起的空間限制引起的表觀穩(wěn)定性表觀穩(wěn)定性非共價修飾非共價修飾 反相膠束 添加劑:專一性底物及配體;非專一性中性鹽和多羥基物

8、質;與失活劑競爭的物質;除掉破壞化學催化劑的物質 蛋白質間非共價相連化學修飾：化學修飾：修飾作用可達到穩(wěn)定酶的作用，得到可溶性穩(wěn)定化酶?？扇苄源蠓肿有揎椕福嚎扇苄源蠓肿有揎椕福?. 聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等。小分子修飾酶小分子修飾酶原因：原因：修飾有時會獲得不同于天然蛋白質構象的更穩(wěn)定的構象；修飾關鍵功能基團也會達到穩(wěn)定化；由化學修飾引入到蛋白質的新的功能基有可能形成附加氫鍵或鹽鍵；用非極性試劑修飾可加強蛋白質中疏水相互作用；蛋白質表面基團的親水性；交聯(lián)酶晶體蛋白質工程：蛋白質工程：用基因操縱技術高度專一性地改變目標蛋白質。優(yōu)點：提供了有目的改變酶性能的可能性，不僅改變酶的結構，也可以改變其催化活力及專一性和穩(wěn)定性。定點突變是其技術上的主要思路：工程二硫鍵；增加蛋白質內部疏水性；酶表面的親水化抗氧化失活； Asn脫胺失活；手段手段:同源雜色體交換同源雜色體交換?思考題 什么叫蛋白質的穩(wěn)定性?如何理解蛋白質的穩(wěn)定性這個概念? 影響蛋白質穩(wěn)定性的主要因素有