免疫組化原理、步驟及要注意的事項

1、免疫組化一，免疫組織化學(xué)簡介免疫組織化學(xué)又稱免疫細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)炕原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì) （如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。二，免疫組化技術(shù)的基本原理免疫組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量；形態(tài)、機能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù)。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認受染細胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機理

2、和病理過程。免疫酶組化技術(shù)是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測組織細胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。三，免疫組化步驟1,切片，烤片 60C, 1h;2,脫蠟及復(fù)水二甲苯 10min,

3、100% 乙醇 5min, 95% 乙醇 5min, 90% 乙醇 5min, 85% 乙醇 5min,80%乙醇 5min, 75% 乙醇 5min, 60% 乙醇 5min, 50% 乙醇 5min, 30% 乙醇 5min,自來水 1min, 雙氧水 1mi n ；3,1 份 30% H2O2加 10 份蒸餾水，室溫10min, 蒸餾水洗 3 次，每次 3min；4,微波修復(fù)將切片浸入 0.01M 枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力(98 E-100 C ) 加熱至沸騰，冷卻 ( 約 5-10min), 反復(fù)兩次；5,將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌 3 次，每次 5min；6, 封閉， 5%

4、BSA,室溫 20min, 甩去多余液體 ;7, 滴加一抗， 37C, 1h, 或者 4C過夜 ;8,PBS洗滌 3 次，每次 3min；9, 滴加二抗， 37°C, 15-30mi n；10, PBS洗滌 3 次，每次 3min；11,滴加 SABC, 37 C , 30min ；12, PBS洗滌 3 次，每次 5min；13, 1ml 蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻;14, DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應(yīng)時間（約5min ）；15,自來水沖洗干凈，過蒸餾水;16,蘇木素復(fù)染 2min, 自來水沖洗 ;17, 脫水30%乙醇 3min, 50% 乙醇 3min

5、, 70% 乙醇 3min, 80%乙醇 3min, 90% 乙醇 3min,95%乙醇 3min, 100% 乙醇 3min, 二甲苯 20min ；18, 樹膠封片，鏡檢。四，免疫組化常見問題分析1,石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；3） 有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；4）用高溫修復(fù)時，溫度驟冷也可能引起。2,邊緣效應(yīng)1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致 ?解

6、決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4 微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用 組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。3, 產(chǎn)生組織切片非特異性染色1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量

7、很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果；5） DAB孵育時間過長或濃度過高；6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤為重要；7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。4, 免疫組化染色呈陰性結(jié)果1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤;2）抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4 次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若

8、不行，還可高壓修復(fù)；3）組織切片本身這種抗原含量低；4）血清封閉時間過長；5） DAB孵育時間過短；6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應(yīng)；7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問5 背景,題。1, 考慮一抗?jié)舛雀?;2, 然后調(diào)整 DAB孵育時間 ;3, 也要考慮血清封閉時間是否過短；4, 適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。免疫組化的經(jīng)驗總結(jié)（1）- 常見問題免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。1 免疫組化實驗所用的組織和細胞標(biāo)本有哪些?實驗所用主要為組織標(biāo)本和細胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片

9、，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC 染色時，需要先進行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱

10、法，酶消化法，水煮加熱法等， 常用的修復(fù)液是pH6.0 的 0.01 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖 液。3、免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原 （抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物 素染色法最常用。4、抗體的保存：抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低(10-100mg/L), 就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%勺牛血清白蛋白。

11、絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4° C -8 C條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20C 條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。抗體經(jīng)真空冷凍干燥后置-20 C 以下 可保存3-5 年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，C下保存數(shù)可在 4月。多聚賴氨酸溶液 (Poly-L-Ly

12、sine Solution多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強的黏合力。適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細胞培養(yǎng)，增加細胞貼壁能力。操作步驟（可直接在玻片上涂布）1. 滅菌的 ddH20 1:10 稀釋該多聚賴氨酸溶液。2.用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-26 C3. 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液 5 分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。4?在 60C 烘箱 1 小時干燥，或室溫18-26 C 過夜干燥待用。注意1.每

13、 100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90 張，超過 90 張片子將影響其黏合力2. 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含 1%HCl 的 70% 乙醇溶液來清洗。4.釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8 C，至少在 3 個月內(nèi)是穩(wěn)定的。5. 用過的稀釋液要過濾，若岀現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。免疫組化的經(jīng)驗總結(jié)（2）- 操作規(guī)程（一）、儀器設(shè)備1） 18cm 不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；2）水浴鍋（二八試劑1）PBS緩沖液（ pH7.2? 7.4 ）: NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L ， KH2PO4 1.4mmol/L。2

14、）0.01mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（ CB，pH6.0，1000m）: 檸檬酸三鈉3g, 檸檬酸0.4?3）0.5mol/LEDTA緩沖液（ pH8.0）: 700ml 水中溶解 186.1gEDTA? 2H2O， 用10 mmol/L NaOH 調(diào)至 pH8.0 加水至 1000m。4）1mol/L 的 TBS緩沖液（ pH8.0）: 在 800ml 水中溶解 121gTris 堿，用 1N 的HCl 調(diào)至 pH8.0 加水至 1000m。5） 酶消化液： a 0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8）配制。 b、0.4% 胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCI 配制。6） 3%

15、甲醇 -H2O2溶液：用 30%H2O2和 80%甲醇溶液配制。7） 封裱劑：a 甘油和 0.5mmol/L 碳酸鹽緩沖液（ pH9.0? 9.5 ）等量混合；b、油和 TBS（或 PBS 配制。8）TBS/PBS pH9.0? 9.5, 適用于熒光顯微鏡標(biāo)本；pH7.0? 7.4 適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。（三）、操作流程1、脫蠟和水化脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置1） 組織芯片置于二甲苯中浸泡1060 分鐘或 60C恒溫箱中烘烤分鐘，更換二甲苯后再浸泡20 分鐘。10 分鐘；2） 無水乙醇中浸泡 5 分鐘； 3） 95%乙醇中浸泡 5 分鐘； 4） 70%乙醇中浸泡 5 分鐘；2、抗原修復(fù)用

16、于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。1）抗原熱修復(fù)（1） 高壓熱修復(fù) 在沸水中加入 EDTA （pH8.0 ）或 0.01M 枸櫞酸鈉緩沖溶液（ pH6.0 ）。蓋 上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡 5 分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。 10 分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（ 2） 煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱 0.01M 枸櫞酸鈉緩沖溶液（ pH6.0 ）至 95C 左右，放 入組織芯片加熱 1015 分鐘。（ 3） 微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱 0.01M 枸櫞酸鈉緩沖溶液（ pH6.0 ）至沸騰后將組織芯片 放入，斷電，間隔 510 分鐘，反復(fù) 1-2 次。適用的抗原有： A