最新分子熒光分析法實驗

1、實驗實驗7 分子熒光光譜法測定分子熒光光譜法測定維生素維生素b2的含量的含量光光譜譜分分析析原原子子光光譜譜（略略）分分子子光光譜譜分分子子吸吸收收u uv v- -v vi is s（紫紫外外- -可可見見）i ir r（紅紅外外）分分子子發(fā)發(fā)光光光光致致發(fā)發(fā)光光其其它它發(fā)發(fā)光光形形式式如如：化化學學發(fā)發(fā)光光等等熒熒光光、磷磷光光(對光的吸收對光的吸收) 當被測物質(zhì)受到光照后，被測物分子吸收了當被測物質(zhì)受到光照后，被測物分子吸收了具有特征頻率的輻射能，分子從基態(tài)上升到激發(fā)具有特征頻率的輻射能，分子從基態(tài)上升到激發(fā)態(tài)，分子在較高能級的激發(fā)態(tài)時，它可能處于激態(tài)，分子在較高能級的激發(fā)態(tài)時，它可能處

2、于激發(fā)態(tài)中各種振動狀態(tài)的一種。然而由于分子通過發(fā)態(tài)中各種振動狀態(tài)的一種。然而由于分子通過與溶劑分子，同類分子或其他分子的碰撞，而失與溶劑分子，同類分子或其他分子的碰撞，而失去振動能級，降低至激發(fā)態(tài)時的最低振動能級，去振動能級，降低至激發(fā)態(tài)時的最低振動能級，在此過程中并不發(fā)光。但當分子從激發(fā)態(tài)的最低在此過程中并不發(fā)光。但當分子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級，即第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降振動能級，即第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降落至基態(tài)的各個不同的振動能級時，則以光的形落至基態(tài)的各個不同的振動能級時，則以光的形式輻射出能量，所輻射出的光即是熒光式輻射出能量，所輻射出的光即是熒光。21v=0321v=0

3、21v=0s0s1s2t1發(fā)生激發(fā)發(fā)生激發(fā)態(tài)反應態(tài)反應分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程21v=0a1a2vrficiscpvr激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn)激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn) 化的形式和速率：化的形式和速率：a1,a2 吸收吸收: 10-15 svr 振動松弛：振動松弛： 10-12 sic 內(nèi)轉(zhuǎn)化：內(nèi)轉(zhuǎn)化： 10-11 sisc 系間竄越：系間竄越： 10-6 10-2 sf 熒光：熒光： 10-9 10-6 sp 磷光：磷光： 10-6 100 s 當固定激發(fā)光波長和強度不變，當固定激發(fā)光波長和強度不變，而記錄熒光強度隨波長變化的曲線，而記錄熒光強度隨波長變化的曲線，稱為熒光光譜。若固

4、定熒光最強處的稱為熒光光譜。若固定熒光最強處的熒光波長不變而改變激發(fā)光波長，記熒光波長不變而改變激發(fā)光波長，記錄熒光強度隨激發(fā)光波長變化的曲線，錄熒光強度隨激發(fā)光波長變化的曲線，稱為激發(fā)光譜。稱為激發(fā)光譜。2503003504004505005506000200400600800 ex.wavelength (nm)relative fluorescence intensity激發(fā)光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜發(fā)射光譜任何熒光化合物，都具有兩種任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。譜。組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息 物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)

5、環(huán)境與介質(zhì)條件環(huán)境與介質(zhì)條件 與其它溶質(zhì)的相互作用與其它溶質(zhì)的相互作用 反應動力學反應動力學o-ocoo-o-ocoo-nh2萘 紫外區(qū)蒽 藍區(qū)丁省 綠區(qū)1）共軛結(jié)構(gòu)2）剛性的平面結(jié)構(gòu)熒光黃會發(fā)熒光酚酞不發(fā)熒光3）取代基f = ki0fc i i0 0：光源強度；：光源強度；f f：熒光量子產(chǎn)率；：熒光量子產(chǎn)率；c c：熒光體濃度）：熒光體濃度）試比較熒光法與紫外試比較熒光法與紫外- -可見分光光度法的分析性能?？梢姺止夤舛确ǖ姆治鲂阅?。?問題：問題：55056057058059060061062006001200180024003000360042004800c fluorescence i

6、ntensitywavelength(nm)（注意：注意：在一定濃度范圍內(nèi)適用）在一定濃度范圍內(nèi)適用）？問題問題：熒光光度計與紫外熒光光度計與紫外- -可見分光光度計在光路設(shè)置可見分光光度計在光路設(shè)置 上有什么不同？為什么？上有什么不同？為什么？ 常規(guī)分析應用：常規(guī)分析應用： 定性分析：定性分析：f；ex；em；峰形等；峰形等 定量檢測：定量檢測： f = ki0fc 其它（略）其它（略） 高端生化研究：高端生化研究： 分子相互作用研究；分子相互作用研究； 代謝動力學跟蹤；代謝動力學跟蹤； 顯微成像顯微成像（物理遷移與化學衍化的原位（物理遷移與化學衍化的原位“顯跡顯跡”）2.1 2.1 實驗原

7、理實驗原理 維生素（核黃素）在一定波長的維生素（核黃素）在一定波長的激發(fā)光照射下會發(fā)射出綠色熒光，根據(jù)熒激發(fā)光照射下會發(fā)射出綠色熒光，根據(jù)熒光強度在一定濃度范圍內(nèi)與熒光物質(zhì)濃度光強度在一定濃度范圍內(nèi)與熒光物質(zhì)濃度成正比，用標準曲線法對樣品進行定量分成正比，用標準曲線法對樣品進行定量分析，在線性良好的情況下，也可用濃度直析，在線性良好的情況下，也可用濃度直接讀出被測樣品的濃度。接讀出被測樣品的濃度。 1、vb2的熒光光譜的繪制的熒光光譜的繪制2、標準工作曲線的制作、標準工作曲線的制作3、未知液的測定、未知液的測定1.開機：開機： 打開打開rf-5301熒光分光光度計的電源開關(guān)，打印機開熒光分光光

8、度計的電源開關(guān)，打印機開關(guān)，開啟電腦。預熱儀器關(guān)，開啟電腦。預熱儀器20分鐘。分鐘。2. 配制系列維生素標準溶液：配制系列維生素標準溶液： 取取5個干凈的個干凈的50ml容量瓶，分別加入容量瓶，分別加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0 , 5.0ml濃度為濃度為10.0g/ml的維生素標準溶液用水稀釋的維生素標準溶液用水稀釋至刻度，搖勻。至刻度，搖勻。3.儀器自檢：儀器自檢： 預熱儀器預熱儀器20分鐘后，雙擊電腦桌面上分鐘后，雙擊電腦桌面上“rf-530xpc”圖標，儀器在計算機的引導下開始自檢，約圖標，儀器在計算機的引導下開始自檢，約3分鐘完畢，此分鐘完畢，此時儀器操作軟件打開。時儀器操

9、作軟件打開。 若此時軟件為若此時軟件為“光譜測定光譜測定”模式，則點擊模式，則點擊“acquire mode”主菜單，在下拉菜單中選擇主菜單，在下拉菜單中選擇“quantitative”，此時軟，此時軟件轉(zhuǎn)為件轉(zhuǎn)為“定量測定定量測定”界面模式。界面模式。4. 參數(shù)設(shè)定：參數(shù)設(shè)定： “定量測定定量測定”界面模式下，點擊界面模式下，點擊“configure”主菜單，主菜單，在下拉菜單中選擇在下拉菜單中選擇“parameters”菜單，則會自動彈出菜單，則會自動彈出“quantitative parameters”窗口，在此窗口中，需要設(shè)窗口，在此窗口中，需要設(shè)置以下五個參數(shù)：置以下五個參數(shù)： 在在

10、“ex wavelength”中填中填270， 在在“em wavelength”中填中填525， 在在“slit widthnm ex”中填中填10， 在在“slit widthnm em”中填中填10， 在在“sensitivity: high low” 中選中選 low，其他參數(shù)，其他參數(shù)選默認值，不要調(diào)整它們，參數(shù)設(shè)置好后，按選默認值，不要調(diào)整它們，參數(shù)設(shè)置好后，按“ok” 此時軟此時軟件自動回到件自動回到“定量測定定量測定”界面模式。此時儀器參數(shù)設(shè)置完畢。界面模式。此時儀器參數(shù)設(shè)置完畢。5.空白溶液測試：空白溶液測試： 設(shè)置好儀器的工作條件后，把裝有去離子水的樣品池置于試樣設(shè)置好儀器

11、的工作條件后，把裝有去離子水的樣品池置于試樣架內(nèi)，在熒光光路上插入架內(nèi)，在熒光光路上插入35濾光片，合上樣品室蓋子，在計濾光片，合上樣品室蓋子，在計算機屏幕上點擊算機屏幕上點擊“auto zero”，觀察屏幕右下腳的基線值接近，觀察屏幕右下腳的基線值接近零時，再點擊零時，再點擊“read”讀數(shù)，得空白溶液數(shù)值。讀數(shù)，得空白溶液數(shù)值。6.系列維生素標準溶液的測試：系列維生素標準溶液的測試： 把各標準樣品按從稀到濃的順序置于試樣架內(nèi)，和空白溶液測把各標準樣品按從稀到濃的順序置于試樣架內(nèi)，和空白溶液測試方法相同，分別測定不同濃度標準溶液的相對熒光強度。試方法相同，分別測定不同濃度標準溶液的相對熒光強度。7. 未知試樣的測定：未知試樣的測定： 將已配制處理好的未知試樣裝入樣品池置于試樣架內(nèi)，用測定將已配制處理好的未知試樣裝入樣品池置于試樣架內(nèi)，用測定標準溶液相同的條件，測其相對熒光強度。標準溶液相同的條件，測其相對熒光強度。8. 關(guān)機：關(guān)機： 先關(guān)計算機，再關(guān)儀器，打印機；清洗樣品池，容量瓶等玻璃先關(guān)計算機，再關(guān)儀器，打印機；清洗樣品池，容量瓶等玻璃儀器，整理好儀