hxj血清清、球蛋白分離新ppt課件

1、何肖娟hxj50701163生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心血清清蛋白、g-球蛋白的分別、提純與鑒定生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心內(nèi)內(nèi) 容容實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理2實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料3實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)驗(yàn)過(guò)程45本卷須知本卷須知生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)?zāi)康膙掌握鹽析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法掌握鹽析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法v掌握凝膠層析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法掌握凝膠層析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法v掌握離子交換層析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法掌握離子交換層析法分別蛋白質(zhì)的原理和根本方法v掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和根本方法掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和根本方法

2、v了解柱層析技術(shù)了解柱層析技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)原理v蛋白質(zhì)的分別和純化是研討蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)的分別和純化是研討蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。其生物學(xué)功能的重要手段。v不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分別純化各種蛋白質(zhì)。別純化各種蛋白質(zhì)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分別純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法常用的純化方法分子質(zhì)量分子質(zhì)量透析、超濾透析、超濾凝膠層析凝膠層析離心離心溶解度溶解度調(diào)整調(diào)整pH調(diào)整離子強(qiáng)度

3、調(diào)整離子強(qiáng)度降低介電常數(shù)降低介電常數(shù)電荷電荷電泳電泳等電聚焦等電聚焦離子交換層析離子交換層析特異結(jié)合部位特異結(jié)合部位親和層析親和層析其他性質(zhì)其他性質(zhì)吸附層析吸附層析液相層析液相層析氣相層析氣相層析生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心球球 蛋蛋 白白 1 2 等電點(diǎn)等電點(diǎn)4.885.065.065.126.857.3相對(duì)分子量相對(duì)分子量1046.9203091515.630含量含量576725496.2121220血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量清蛋白清蛋白 A生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心1. 粗提鹽析法v由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、由于血清中

4、各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。所需的鹽濃度也不一樣。v調(diào)理鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而調(diào)理鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而到達(dá)分別的目的。到達(dá)分別的目的。血清清蛋白血清清蛋白球蛋白球蛋白半飽和硫酸銨半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解球蛋白沉淀，蒸餾水溶解生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2. 脫鹽凝膠層析v鹽析分別的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無(wú)機(jī)鹽，必需鹽析分別的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無(wú)機(jī)鹽，必需先脫鹽后才干進(jìn)一步純化。先脫鹽后才干進(jìn)一步純化。v脫鹽有多種方法，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠

5、層析法。脫鹽有多種方法，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法。v凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分別的技術(shù)。小的不同而將其分別的技術(shù)。凝膠層析分別表示圖凝膠層析分別表示圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心凝凝膠膠層層析析分分別別化化合合物物表表示示圖圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心3.純化離子交換層析v離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)展可逆的交換，利用化合物相上的離子進(jìn)展可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)展分別的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)展分別R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-P

6、r+ + H+陽(yáng)離子交換陽(yáng)離子交換陰離子交換陰離子交換R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白清蛋白pI 4.9，帶負(fù)電荷多，帶負(fù)電荷多a、b球蛋白球蛋白pI 5.05.2，帶負(fù)電荷少帶負(fù)電荷少 、 球蛋白被洗脫球蛋白被洗脫, ,清蛋白仍被吸附清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及清蛋白及a、b球蛋白的球蛋白的pI6.5 ，帶負(fù)電荷，帶負(fù)電荷g球蛋白球蛋白pI 6.5，帶正電荷帶正電荷清蛋白及清蛋白及a、b球蛋白球蛋白被層析柱吸附被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫球蛋白被洗脫0

7、.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強(qiáng)度添加緩沖液離子強(qiáng)度添加清蛋白被洗脫清蛋白被洗脫生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心4.純度鑒定電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心三、實(shí)驗(yàn)資料v人血清人血清v葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-25)層析柱層析柱vDEAE纖維離子交換層析柱纖維離子交換層析柱v飽和硫酸銨溶液飽和硫酸銨溶液v20%磺基水楊酸磺基水楊酸v1%BaCl2溶液溶液v電泳儀、電泳槽電泳儀、電泳槽生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程v鹽析粗分別鹽析粗分別v葡聚糖凝膠層析脫鹽葡

8、聚糖凝膠層析脫鹽vDEAE纖維素離子交換層析純化纖維素離子交換層析純化v醋酸纖維素薄膜電泳純度鑒定醋酸纖維素薄膜電泳純度鑒定用用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁清洗層析柱內(nèi)壁, 取血清取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置混勻室溫放置10min，4000r/min離心離心10min沉淀含球蛋白加水沉淀含球蛋白加水 0.6ml溶解溶解上清液含清蛋白、少量上清液含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白和球蛋白約球蛋白約0.8ml用用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁清洗層析柱內(nèi)壁, 凝凝

9、 膠膠 柱柱 層層 析析 除除 鹽鹽繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩緩沖液沖液(2ml)洗脫，流出液量約洗脫，流出液量約2ml磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)搜集含有蛋白質(zhì)的峰液搜集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)能夠同時(shí)陽(yáng)性繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/L NH4AC緩沖緩沖液洗滌約液洗滌約2mlBaCl2檢測(cè)SO42-陰性用用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平緩沖液再生平衡衡過(guò)葡聚糖凝膠過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱層析柱1.07cm過(guò)葡聚糖凝膠過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱層析柱1.07cm繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩緩

10、沖液洗脫，流出液量約沖液洗脫，流出液量約2ml磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)搜集含有蛋白質(zhì)的峰液搜集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)能夠同時(shí)陽(yáng)性繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/L NH4AC緩沖緩沖液洗滌約液洗滌約2mlBaCl2檢測(cè)SO42-陰性用用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平緩沖液再生平衡衡鹽鹽析析操作流程操作流程離子交換柱層析純化離子交換柱層析純化加樣加樣加樣加樣用用1ml 0.0mol/L NH4AC緩沖液緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁清洗層析柱內(nèi)壁, 離 子 交 換 柱 層 純 化除鹽后搜集的清蛋白除鹽后搜集的清蛋白用用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液

11、緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁清洗層析柱內(nèi)壁, 取濃度最高的取濃度最高的1管作純度鑒定管作純度鑒定醋酸纖維素薄膜電泳法醋酸纖維素薄膜電泳法繼續(xù)用繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩緩沖液沖液(3ml)洗脫，流出液量約洗脫，流出液量約2ml磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)搜集含有蛋白質(zhì)的洗脫液搜集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管每管10d，延續(xù)搜集，延續(xù)搜集3管管DEAE-纖維素柱不用再生，纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白可直接用于純化清蛋白除鹽后搜集的球蛋白除鹽后搜集的球蛋白過(guò)過(guò)DEAE-纖維素層析柱纖維素層析柱1.06cm過(guò)過(guò)DEAE-纖維素層析柱纖維素層析柱1.06cm用約用約mL 0.06mol/L

12、 NH4AC緩沖液流洗，緩沖液流洗，除去除去球蛋白和球蛋白和球蛋白球蛋白用用0.3mol/L NH4AC緩沖液緩沖液(約約3ml)洗脫，洗脫，流出液量約流出液量約2.5ml磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)搜集含有清蛋白的洗脫液搜集含有清蛋白的洗脫液每管每管10d，延續(xù)搜集，延續(xù)搜集2管管DEAE-纖維素柱先用纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩緩沖液流洗再生平衡沖液流洗再生平衡離子交換柱再生和蛋白純度鑒定2管均作純度鑒定管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法醋酸纖維素薄膜電泳法)生物化學(xué)與分子生

13、物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心五、本卷須知v所用血清應(yīng)新穎，無(wú)沉淀物及細(xì)菌繁殖。所用血清應(yīng)新穎，無(wú)沉淀物及細(xì)菌繁殖。v運(yùn)用時(shí)勿將各時(shí)段所運(yùn)用的溶液濃度弄錯(cuò)。運(yùn)用時(shí)勿將各時(shí)段所運(yùn)用的溶液濃度弄錯(cuò)。v上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁參與樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁參與樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。v洗脫時(shí)應(yīng)留意及時(shí)搜集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，洗脫時(shí)應(yīng)留意及時(shí)搜集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并留意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。并留意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。v切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的的

14、BaCl2混淆，混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。v葡聚糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生葡聚糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生,防止損耗，嚴(yán)禁倒掉防止損耗，嚴(yán)禁倒掉!生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心醋酸纖維素薄膜電泳原理 血漿中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，普通都低于血漿中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，普通都低于pH7.4。它們?cè)?。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極挪動(dòng)。由于血漿中各種蛋白質(zhì)分在電場(chǎng)中向正極挪動(dòng)。由于血漿中各種蛋白質(zhì)分子大小、外形及所帶的電荷量不同，因此在醋酸子大小、外形及所帶的電荷量不同，因此在醋酸纖維素薄膜上

15、電泳的速度也不同。因此可以將它纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分別為清蛋白們分別為清蛋白Albumin)、1-球蛋白、球蛋白、2-球球蛋白、蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白5條區(qū)帶。條區(qū)帶。生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心醋酸纖維素薄膜電泳1. 點(diǎn)樣點(diǎn)樣(粗面粗面)8cm2cm點(diǎn)樣線點(diǎn)樣區(qū)1.5cm(粗面小組標(biāo)志小組標(biāo)志樣品標(biāo)志樣品標(biāo)志生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2. 電泳電泳 薄膜粗面向下 點(diǎn)樣端置陰極端 兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)悄然拉平 留意：切勿使點(diǎn)樣處與電泳槽接觸電壓：電壓：110V時(shí)間：時(shí)間：50min。生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心3. 染色和漂洗染色和漂洗 電泳終了后，封鎖電源，將膜取出，電泳終了后，封鎖電源，將膜取出，直接浸于染色液中直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色普通改換液中浸洗脫色普通改換2次，至背景顏次，至背景顏色脫凈為止。色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。取出膜，用濾紙吸干即可。生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心思索題v1.硫酸銨鹽析一步硫酸銨鹽析一步,為什么是為什么是0.8ml血清加血清加0.8ml飽飽和硫酸銨和硫酸銨?v2.為什么實(shí)驗(yàn)中為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分別纖維素柱分別-球蛋白后不球蛋白后不用再生用再生,可直接用于純