基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序復習復習1.什么是基因工程？什么是基因工程？2.基因工程的基本工具有哪些？基因工程的基本工具有哪些？3.基因工程的最大優(yōu)點？基因工程的最大優(yōu)點？4.“分子手術刀分子手術刀”、“分子縫合針分子縫合針”和和“分子運分子運輸車輸車” 分別指什么？分別指什么？5.質(zhì)粒的本質(zhì)、特點是什么？載體的種類、必質(zhì)粒的本質(zhì)、特點是什么？載體的種類、必須具備的條件？須具備的條件？1.目的基因目的基因的獲取的獲取2.基因表達基因表達載體的構建載體的構建3.將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞導入受體細胞4.目的基因的目的基因的檢測與鑒定檢測與鑒定基因工程的基本操作分四個

2、步驟基因工程的基本操作分四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用 載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化體內(nèi)的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻母拍睿海ㄒ唬┠康幕虻母拍睿?編碼

3、蛋白質(zhì)的結(jié)構基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構基因,也可以是一些具有也可以是一些具有調(diào)控作用的因子調(diào)控作用的因子（二）獲取目的基因的常用方法有哪些（二）獲取目的基因的常用方法有哪些?1.從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取2.利用利用PCR技術擴增技術擴增3.人工合成人工合成1.從基因文庫中直接獲取從基因文庫中直接獲?。?）基因文庫的概念：）基因文庫的概念：（2）基因文庫的分類）基因文庫的分類:種種類類基因組文庫：基因組文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，如：基因，如：cDNA文庫文庫（3）獲取目的基因的依據(jù)：）獲取目的

4、基因的依據(jù)：某生物體內(nèi)全部某生物體內(nèi)全部DNA 許多許多DNA片段片段受體菌群體受體菌群體（4）基因文庫的構建方法）基因文庫的構建方法限制酶限制酶與運載體與運載體連接連接基因組文庫基因組文庫某種生物某個時期的某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體受體菌群體與運載體與運載體連接連接部分基因文庫部分基因文庫（cDNA文庫）文庫）導入導入導入導入基因組文庫的構建基因組文庫的構建通過對受通過對受體菌的培體菌的培養(yǎng)而儲存養(yǎng)而儲存基因基因 cDNA文庫的構文庫的構建建-反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使錄成的信使RNARNA為模為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補板，反轉(zhuǎn)錄成互補的

5、單鏈的單鏈DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成雙酶的作用下合成雙鏈鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA( (目的基因目的基因) ) 概念：概念：PCR全稱為全稱為_，是一項，是一項在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術。的核酸合成技術。 條件：條件：_、_ 、 _、_原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNA片段片段DNA復制復制已知基因的核苷酸序列（前提）已知基因的核苷酸序

6、列（前提）四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物耐熱的耐熱的DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）指數(shù)指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍萬倍地擴增地擴增2.利用利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因過程：過程：a.DNA變性變性(90-95):雙鏈雙鏈DNA模板在熱作用模板在熱作用下，下，_斷裂，形成斷裂，形成_。b.退火退火(復性復性55-60):系統(tǒng)溫度降低，引物與系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c.延伸延伸(70-75):在在Taq酶的作用下，從引物酶的作用下，從引物處延伸，合成與模板互補的處延伸，合成與模

7、板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA鏈鏈PCR技術擴增與技術擴增與DNA復制的比較復制的比較PCR技術技術DNA復制復制相相同同點點原理原理原料原料條件條件不不同同點點解旋解旋方式方式場所場所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補配對堿基互補配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性在高溫下變性解旋解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復制體外復制主要在細胞核主要在細胞核熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶 細胞內(nèi)的細胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分子分子目的基因的目的基因的mRNA單鏈單鏈DNA (cDNA）雙鏈雙鏈DNA(即目的

8、基因即目的基因)反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄合成合成1）反轉(zhuǎn)錄法：）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈的單鏈DNA，然后在酶的，然后在酶的作用下合成雙鏈作用下合成雙鏈DNA，從而，從而獲得所需的基因。獲得所需的基因。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的氨基的氨基酸序列酸序列mRNA的核苷的核苷酸序列酸序列結(jié)構基因結(jié)構基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推測推測化學化學合成合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：3.人工合成目的基因人工合成目的基因 1.下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用利用

9、mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取利用庫中提取從受體細胞中提取利用PCR技術合成利用技術合成利用DNA轉(zhuǎn)錄形成轉(zhuǎn)錄形成 人工合成人工合成A. B. C. D. D二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建基因工程的基因工程的 核心核心1.1.目的：目的： 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。能夠表達和發(fā)揮作用。啟動子啟動子插入基因插入基因表達載體表達載體復制原點復制原點抗生素基因抗生素基因終止子終止子基因表達載體基因表達載體模式圖模式圖

10、2.基因表達載體的組成基因表達載體的組成(1)啟動子啟動子(2)終止子終止子(3)目的基因目的基因(4)標記基因等標記基因等它們各自的作用是什么它們各自的作用是什么? ?啟動子啟動子插入基因插入基因表達載體表達載體復制原點復制原點抗生素基因抗生素基因終止子終止子知識點一知識點一 原核細胞的基因結(jié)構原核細胞的基因結(jié)構非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子能轉(zhuǎn)錄相應的信使能轉(zhuǎn)錄相應的信使RNA，能，能編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)：編碼區(qū)：非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的基的基因結(jié)因結(jié)構

11、構有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。聚合酶結(jié)合位點。包括啟動子和終止子包括啟動子和終止子不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋，不能編碼蛋 白質(zhì)。白質(zhì)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子啟動子啟動子:位于基因首端的一段能與位于基因首端的一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能聚合酶結(jié)合并能起始起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶

12、聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)一種蛋白質(zhì)。(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)終止子終止子:位于基因尾端的一段特殊的位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。真核真核細胞細胞的的基因基因結(jié)構結(jié)構編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點等。聚合酶結(jié)合位

13、點等。編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列知識點二知識點二 真核細胞的基因結(jié)構真核細胞的基因結(jié)構原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構比較原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構比較連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼

14、非編碼在細胞質(zhì)中在細胞質(zhì)中將將mRNA分離并分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶加入反轉(zhuǎn)錄酶合成第二條合成第二條DNA鏈鏈外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子外顯子外顯子 外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子真核細胞的基因真核細胞的基因在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA在核內(nèi)內(nèi)含子在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子被切去，外顯子彼此連接彼此連接在細胞質(zhì)中將在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成第二條合成第二條DNA鏈鏈基因的基因的cDNA不含不含內(nèi)含子內(nèi)含子mRNA原核細胞的基因原核細胞的基因在細胞質(zhì)在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄內(nèi)轉(zhuǎn)錄啟動子：啟動子：位于基因的位于基因的首端的一段特殊的首端的一段特殊的DNA片斷，它是片斷，它是RNA聚

15、合酶聚合酶識別和結(jié)合的部位，識別和結(jié)合的部位，有了它才能有了它才能驅(qū)動基因驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終，最終獲得蛋白質(zhì)獲得蛋白質(zhì)。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNA片片斷，斷，能終止能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄。標記基因：標記基因：為了為了鑒別鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。啟動子啟動子插入基因插入基因表達載體表達載體復制原點復制原點抗生素基因抗生素基因終止子終止子質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端二個切口二個切口

16、獲得目的基因獲得目的基因DNA重組重組DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種3.過程過程:連接酶連接酶切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種酶，以獲得相同的粘性末端，利于重組質(zhì)粒的酶，以獲得相同的粘性末端，利于重組質(zhì)粒的構建。構建。插入的目的基因只是結(jié)構基因部分，其表達插入的目的基因只是結(jié)構基因部分，其表達需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部位前須有啟動子，后須有終止子。位前須有啟動子，后須有終止子。注意：注意：資資料料科學家在培育抗蟲棉時，科學家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的起初把蘇云金芽孢

17、桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。沒有表達。 啟動子啟動子插入基因插入基因表達表達載體載體復制復制原點原點抗生素抗生素基因基因終止子終止子然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子啟動子，導入棉花受精卵，長成的棉花植株，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子終止子，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了導入棉

18、花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力?？瓜x能力。 資料證明：載體構建組成要完整資料證明：載體構建組成要完整載體載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎片段。表達載體在載體基礎上增加了上增加了目的基因、啟動子、終止子目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構三部分結(jié)構用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用既用到限制酶切割載體，又用到到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的

19、基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以必需以表達載體的方式攜帶進去。表達載體的方式攜帶進去。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞(一一)轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化： (二二)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過

20、程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達1.將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ簩⒛康幕驅(qū)胫参锛毎姆椒ǎ阂赘腥倦p子葉植物和裸子植物，對易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。上。過程：過程：優(yōu)點：比較經(jīng)濟和有效優(yōu)點：比較經(jīng)濟和有效Ti質(zhì)粒質(zhì)粒T-DNA攜帶外源攜帶外源基因的基因的DNA構建表達載體構建表達載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌含目的基因的含目的基因的重組重組

21、Ti質(zhì)粒質(zhì)粒導入植物細胞導入植物細胞植物細胞植物細胞將目的基因插入將目的基因插入染色體的染色體的DNA中中表現(xiàn)出新性狀表現(xiàn)出新性狀的植株的植株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Hind限制性酶限制性酶HindIIIHindIII目的目的DNATi質(zhì)粒質(zhì)粒蘇云金桿菌蘇云金桿菌構建表達載體構建表達載體Bt毒素毒素蛋白基因蛋白基因 蘇云金桿菌蘇云金桿菌T-DNA(可轉(zhuǎn)移可轉(zhuǎn)移-DNA) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：目的目的DNAamp黏性末端黏性末端在質(zhì)粒的在質(zhì)粒的tet基因內(nèi)切開基因內(nèi)切開目的目的DNA質(zhì)粒和外源質(zhì)粒和外源DNA的的Hind限制性限制性酶切示意圖酶切示意圖DNA連接酶

22、連接酶脫分化脫分化導入植物細胞通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體導入植物細胞通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體再分化再分化移植移植個體生物學個體生物學水平的鑒定水平的鑒定如蟲吃后中毒死亡，則說明如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達攝入了抗蟲基因并得到表達導入植導入植物細胞物細胞組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌（2）基因槍法：適合單子葉植物基因槍法：適合單子葉植物（3）花粉管通道法：如抗蟲棉花粉管通道法：如抗蟲棉目的目的基因基因子房子房花粉管通道法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩┤÷眩ㄊ?/p>

23、精卵） 顯微注射顯微注射受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少物質(zhì)少方法：方法：用用Ca2+處理細胞處理細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合 細胞吸收細胞吸收DNA分子分子感受態(tài)感受態(tài)Ca2+處理法處理法若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾和高爾基體上加工完成，而

24、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類）可以，酵母菌為真核生物（真菌類）四四. .目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測檢測(分子分子水平水平)鑒定鑒定（個體水平）（個體水平）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、

25、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之分子雜交（注意與上不同之處）處）抗原抗原-抗體雜交抗體雜交（一）檢測（一）檢測1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因 (關鍵步驟關鍵步驟)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位 素等作標記素等作標記,以此做探針以此做探針使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯 示出雜交帶示出雜交帶,表明目的基因已插入染色

26、體表明目的基因已插入染色體 DNA中中（1）方法）方法: DNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:目的基因片段目的基因片段非目的基因片段非目的基因片段目的基因片段目的基因片段放射性標記放射性標記基因探針基因探針基因探針基因探針目的基因的檢測示意圖目的基因的檢測示意圖DNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列一起，形成雜合雙鏈區(qū)

27、；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法方法: 分子雜交分子雜交過程過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了出了mRNA提取提取3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法抗原抗原-抗體雜交抗體雜交蘇云金桿菌蘇云金桿菌Bt毒素蛋白毒素蛋白將將Bt毒蛋白毒蛋白注射小鼠體內(nèi)注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管從小鼠血管抽出血液分離抽出血液分離出抗出抗Bt毒素的毒素的抗體抗體抗體抗體蛋白質(zhì)蛋

28、白質(zhì)(抗原抗原) 出現(xiàn)出現(xiàn)雜交帶雜交帶脫脫分分化化組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)證明：證明：提取蛋白質(zhì)與提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣毒素蛋白質(zhì)一樣例例: :用棉鈴飼喂棉鈴蟲，用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達?？瓜x基因并得到表達。（二）（二）鑒定鑒定個體生物學水平的鑒定個體生物學水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗 不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，

29、才能說明目的基因完成了性狀，才能說明目的基因完成了表達表達。 受體細胞攝入受體細胞攝入DNA分子后就說明目的分子后就說明目的基因完成了表達嗎？基因完成了表達嗎？若不能表達，若不能表達，要對抗蟲基因要對抗蟲基因再進行再進行修飾修飾。歸納歸納: : 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRu化學方法人工合成化學方法人工合成2.構建基因表達載體構建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.目

30、的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：分子水平；是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：分子水平；是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：個體生物學水平鑒定：個體生物學水平1.有關基因工程的敘述正確的是有關基因工程的敘述正確的是 A.限制酶只在獲得目的基因時才用限制酶只在獲得目的基因時才用B.重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C.質(zhì)粒都可作為運載體質(zhì)粒都可作為運載體D.蛋白質(zhì)的結(jié)構可為合成目的基因提供蛋白質(zhì)的結(jié)構可為合成目的基因提供 資料資料D練習練習2.基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上進行分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補

31、配對的步驟是中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成目的基因人工合成目的基因B.目的基因與運載體結(jié)合目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞 D.目的基因的檢測和表達目的基因的檢測和表達C練習練習3.(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構建重組獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的的限

32、制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，處，DNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”或或“b”）aa(2)將重組將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和_。(3)由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用要利用_技術，該技術的核心技術，該技術的核心是是_和和_?；驑尫ɑ驑尫ㄖ参锝M織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)（花粉管通道法）（花粉管通道法）脫分化脫分化再分化再分化(4)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的既要用放射性同位素標記的_作探針進行分

33、子雜交檢測，又要用作探針進行分子雜交檢測，又要用_方法從個體水平鑒定水稻方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。植株的耐鹽性。耐鹽基因耐鹽基因濃度鹽水澆灌濃度鹽水澆灌一定一定 4.4.（20092009年天津高考改編）為從根本上解年天津高考改編）為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)Q水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)胨荆嘤椭菜徂D(zhuǎn)基因水稻品種。如圖入水稻，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。如圖是獲取植酸酶基因的流程。是獲取植酸酶基因的流程。酵母菌DNAmRNAcDNAcDNA文庫基因組文庫含目的基因的菌株目的基因含目的基因的菌株目的基因提取提取構建篩選篩選構建ABC分離分離 據(jù)圖回答

34、：據(jù)圖回答：（1 1）圖中基因組文庫）圖中基因組文庫 cDNAcDNA文庫。文庫。（2 2）B B過程需要的酶是過程需要的酶是 （3 3）目的基因和除可從構建的文庫中分）目的基因和除可從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中離外，還可以分別利用圖中 和和 為模板直接進行為模板直接進行PCRPCR擴增，該過程中所用擴增，該過程中所用酶的顯著特點是酶的顯著特點是（4 4）A A、C C過程中都是篩選獲取目的基因過程中都是篩選獲取目的基因的過程，請說出篩選的依據(jù)的過程，請說出篩選的依據(jù)大于逆轉(zhuǎn)錄酶DNAcDNA耐高溫可依據(jù)基因的相關信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及基因的表達產(chǎn)物等）獲取目的基因。5.下列有關基因工程的敘述下列有關基因工程的敘述,正確的是正確的是()。A.載體上的標記基因有利于促進目的基因在受體細載體上的標記基因有利于促進目的基因在受體細 胞中表達胞中表達B.用逆轉(zhuǎn)錄法合成胰島素基因時只能從胰島用逆轉(zhuǎn)錄法合成胰島素基因時只能從胰島B細胞細胞 中提取相關的模板中提取相關的