大白菜-結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體(ACC)基于25S+rDNA的FISH分析

1、園藝學(xué)報(bào)，（）： 2014411224022410 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140811；修回日期：20141024 基金項(xiàng)目：十二五農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012AA100102）；農(nóng)業(yè)科研杰出人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2130106）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171964）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2014204135） 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）基于25S rDNA的FISH分析 軒淑欣1，趙玉靖1，王彥華1，郄麗娟2，李曉峰1，申書興1,* （1

2、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，石家莊 050061） 摘 要：應(yīng)用25S rDNA-FISH對(duì)大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）中期染色體組成和減數(shù)分裂染色體行為進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了花粉特性和結(jié)實(shí)性的研究。結(jié)果表明，大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體染色體數(shù)為28，含有9個(gè)25S rDNA位點(diǎn)，其中4個(gè)來自結(jié)球甘藍(lán)4號(hào)和7號(hào)染色體；5個(gè)來自大白菜1 5號(hào)染色體；A、C基因組間不同染色體同源程度不同，減數(shù)分裂終變期常形成單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體等不同的聯(lián)會(huì)方式；中期和中期存在游離染色體；后期和后期染色體分離不均衡，并存在染

3、色體落后或丟失；末期有微核產(chǎn)生。異源三倍體花粉整齊度和生活力遠(yuǎn)低于其二倍體親本，自交及與親本甘藍(lán)（CC）回交的結(jié)籽率都極低，僅為0.01%。 關(guān)鍵詞：大白菜；結(jié)球甘藍(lán)；異源三倍體；FISH 中圖分類號(hào)：S 634.1；S 635.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）12-2402-09 FISH Analysis Based on 25S rDNA in Chinese CabbageHead Cabbage Allotriploid（ACC） XUAN Shu-xin1，ZHAO Yu-jing1，WANG Yan-hua1，QIE Li-juan2，LI Xiao-

4、feng1，and SHEN Shu-xing1,* （1Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei，College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2Institute of Cash Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050061，China） Abstract

5、：25S rDNA-FISH was applied to analyze metaphase chromosome components and meiotic chromosome behavior of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid（ACC），and pollen character and the fecundity of the allotriploid was studied. In the 25S rDNA-FISH analysis for metaphase chromosomes，Chinese cabbagehead c

6、abbage allotriploid was verified to have 28 chromosomes and contains 9 locis of 25S rDNA，among them 4 locis mapping on chromosome 4 and 7 of head cabbage，and the other 5 locis mapping on chromosome 15 of Chinese cabbage. There was different degree of homology between A chromosomes and C chromosomes.

7、 At meiotic diakinesis，the chromosomes often form different association patterns，such as univalent，bivalent，and trivalent，etc. There were dissociated chromosomes at metaphaseand ，chromosome unequally segregating，lagging and losing at anaphaseand anaphase * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：shens

8、x） 12期 軒淑欣等：大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）基于25S rDNA的FISH分析 2403 ，and micronuclei forming at telophase. These results led to that pollen regularity and pollen viability of allotriploid was much lower than that of its diploid parents. Whether this allotriploid was selfing or backcross with head cabbage，the seed s

9、etting rate was very low，only 0.01%. Key words：Chinese cabbage；head cabbage；allotriploid；fluorescence in situ hybridization（FISH） 異附加系是進(jìn)行外源優(yōu)益基因轉(zhuǎn)移、基因染色體定位、物理圖譜構(gòu)建、染色體組間部分同源性關(guān)系等研究的重要材料（Okagaki et al.，2001；Akaba et al.，2009；Geleta et al.，2012；Heneen et al.，2012；董輝 等，2013）。異附加系一般是通過兩個(gè)種間的異源三倍體與其二倍體親本回交產(chǎn)生，

10、并通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子標(biāo)記等方法鑒定獲得。因此，異源三倍體的合成是異附加系創(chuàng)建的必要環(huán)節(jié)。在蕓薹屬作物上，利用異源三倍體為中間材料已創(chuàng)建了多套以白菜（A基因組）為遺傳背景附加甘藍(lán)（C基因組）不同染色體的異附加系，如白菜芥藍(lán)異附加系（Hasterok et al.，2005；Heneen et al.，2012）、大白菜結(jié)球甘藍(lán)異附加系（劉煒 等，2008；顧愛俠 等，2009；呂文欣 等，2011）、菜薹芥藍(lán)異附加系（Wang et al.，2008；陳雪平 等，2010）等，但以甘藍(lán)（C基因組）為遺傳背景附加白菜（A基因組）染色體的附加系報(bào)道極少。任艷蕊等（2009）通過四倍體

11、芥藍(lán)與二倍體菜薹雜交合成了芥藍(lán)菜薹異源三倍體（CCA），并以該異源三倍體（CCA）為種間材料，合成了以芥藍(lán)為遺傳背景附加菜薹染色體的附加系（任艷蕊 等，2010；Li et al.，2013）。 結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata，2n = 18，CC）和大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis，2n = 20，AA）分屬十字花科蕓薹屬C、A二倍體基本種，均以葉球?yàn)槭秤闷鞴?，在中?guó)蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。為創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，并嘗試開展以結(jié)球甘藍(lán)為遺傳背景附加大白菜染色體的附加系創(chuàng)建工作，作者的研究團(tuán)隊(duì)開展了結(jié)球甘藍(lán)同源

12、四倍體與大白菜二倍體的雜交工作，獲得了大白菜細(xì)胞質(zhì)背景的大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）新材料（顧愛俠 等，2008）。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是20 世紀(jì)80 年代末發(fā)展起來的一種重要的分子細(xì)胞遺傳學(xué)工具，以核糖體RNA 基因（rDNA）為探針的染色體FISH是對(duì)染色體較小且形態(tài)相近的物種進(jìn)行染色體分析的有效手段（徐延浩 等，2007；Kwon & Kim，2009），被較多地用于蕓薹屬染色體分析（Fukui et al.，1998；Hasterok et al.，2001，2005；Kulak et al.

13、，2002；軒淑欣 等，2007，2013）。本研究中利用25S rDNA-FISH對(duì)大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）進(jìn)行了中期染色體組成和減數(shù)分裂染色體行為分析，并對(duì)其花粉特征以及結(jié)實(shí)性進(jìn)行了觀察，旨在為結(jié)球甘藍(lán)大白菜異附加系的選育及精確鑒定提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 供試材料大白菜（AA，2n = 2x = 20）、結(jié)球甘藍(lán)（CC，2n = 2x = 18）及大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜遺傳育種課題組提供。其中大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）是本課題組利用二倍體大白菜和四倍體結(jié)球甘藍(lán)人工雜交授粉結(jié)合幼胚離體培養(yǎng)獲得（顧愛俠 等，2008）。供

14、試探針為來自擬南芥25S rDNA編碼區(qū)的一個(gè)2.3 kb的亞克隆，由波蘭的Dr. Robert Hasterok提供。 將供試材料組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，切取合適的根尖在0.002 mol · L-1 8羥基喹啉中預(yù)處理2 h，然后置于卡諾固定液（酒精甲醇 = 31）中固定，用于中期染色體制片；另一部分生根組培苗于冬季栽培到陽(yáng)畦，次年3月份定植，初花期取不同發(fā)育時(shí)期的花蕾卡諾固定液固定，用于減數(shù)分裂 2404 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 染色體制片。 1.2 染色體制備 根尖染色體制片：將固定后的根尖在蒸餾水中浸洗2 3次，切取根尖生長(zhǎng)點(diǎn)放入2%的纖維素酶（“Onozuka”R-10，日本

15、）和2%的果膠酶（pectinase，Serva）混合液中，在25 下酶解1.5 2.0 h，蒸餾水中后低滲30 min，在載玻片上涂片，然后火焰干燥，選染色體分散、形態(tài)良好的制片用于FISH。 減數(shù)分裂染色體制片：將固定的異源三倍體幼蕾在蒸餾水中浸洗2 3次，取1個(gè)花藥采用蘇木精染色壓片用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，確定所處的時(shí)期，其余5個(gè)花藥放入1.5 mL離心管中，加入2%的纖維素酶和2%的果膠酶混合液100 L，在25 下酶解2 2.5 h吸去酶液，用蒸餾水洗2 3次，換為新鮮的卡諾固定液，然后用小吸管輕輕吹打，使花藥破碎細(xì)胞完全散開，吸取少量細(xì)胞懸浮液滴片，火焰干燥后20 保存?zhèn)溆?/p>

16、。 1.3 原位雜交及信號(hào)檢測(cè) 采用堿裂解法提取25S rDNA亞克隆DNA，采用DIG-Nick Translation kit試劑盒（Roche，德國(guó)）進(jìn)行標(biāo)記。制備好的染色體標(biāo)本，在60 烘箱內(nèi)烤片1 h，70 下用2× SSC配制的70%去離子甲酰胺變性2.5 min，立即在20 下預(yù)冷的70%、95%、100%酒精系列浸洗脫水各5 min，自然干燥。在染色體變性的同時(shí)配制雜交液，75 下變性5 min，迅速置于冰上至少5 min。 加雜交液于染色體玻片上，蓋上蓋玻片置于保濕盒中在37 雜交16 21 h。 雜交后用2× SSC在37 浸洗3次，每次5 min，用羊

17、抗地高辛熒光素抗體和兔抗羊FITC偶聯(lián)物檢測(cè)雜交信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后用1× PBS 在室溫下浸洗3次，每次5 min，避光自然干燥。 染色體制片用2 g · mL-1 DAPI復(fù)染。在Zeiss熒光顯微鏡（Axioskop 40）下觀察熒光原位雜交信號(hào)，用CCD照相裝置捕獲圖像，用Axiovision Imaging System和Photoshop 軟件對(duì)圖像進(jìn)行合成和處理。 1.4 花粉量、花粉生活力測(cè)定和雜交結(jié)實(shí)率調(diào)查 花粉量采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)?；ǚ凵盍y(cè)定采用TTC染色法（張子學(xué)和孫峰，2002）。 采用蕾期人工去雄授粉的方法進(jìn)行二倍體甘藍(lán)與異源三倍體雜種的正交

18、和反交，統(tǒng)計(jì)其結(jié)莢率和結(jié)籽率。結(jié)莢率（%）= 坐莢數(shù)/授粉花蕾數(shù) × 100；結(jié)籽率（%）= 每種莢平均種子數(shù)/每種莢平均胚珠數(shù) × 100。 2 結(jié)果與分析 2.1 25S rDNA在大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體根尖中期染色體上的FISH分析 25S rDNA在大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體及其二倍體親本根尖中期染色體上的FISH定位表明，大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體染色體數(shù)為2n = 28條，其中9條染色體上檢出了25S rDNA-FISH信號(hào)（圖1，A，綠色）。 對(duì)照先前發(fā)表的大白菜和結(jié)球甘藍(lán)基于25S rDNA-FISH的核型（Lim et al.，2005；王太霞 等，2006

19、；軒淑欣 等，2007）進(jìn)行分析，建立異源三倍體基于25S rDNA-FISH信號(hào)的核型，表明該異源三倍體含有2套結(jié)球甘藍(lán)來源的染色體和1套大白菜來源的染色體，其中4個(gè)信號(hào)位于結(jié)球甘藍(lán)的4號(hào)和7號(hào)染色體；另5個(gè)信號(hào)位于大白菜的1 5號(hào)染色體（圖1，B）。 12期 軒淑欣等：大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）基于25S rDNA的FISH分析 2405 A 圖1 25S rDNA探針在大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體有絲分裂中期染色體上的雜交及核型 A：25S rDNA在異源三倍體（ACC）中期染色體上的分布；B：異源三倍體（ACC）基于25S rDNA-FISH信號(hào)核型圖。 C1 C9為結(jié)球甘藍(lán)染色體

20、編號(hào)；A1 A10為大白菜染色體編號(hào)。 Fig. 1 25S rDNA FISH mapping on metaphase chromosomes of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid（ACC）and karyotype A：Distribution of 25S rDNA on Chinese cabbagehead cabbage allotriploid；B：Karyotype image of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid based on 25S rDNA-FISH. C1C9 wa

21、s number of head cabbage chromosomes，respectively； A1A10 was number of Chinese cabbage chromosomes，respectively. 2.2 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體減數(shù)分裂染色體行為的25S rDNA-FISH分析 表1 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體終變期 染色體聯(lián)會(huì)構(gòu)型及個(gè)數(shù) Table 1 Chromosome configuration number of Chinese Cabbagehead cabbage allotriploid at diakinesis 染色體構(gòu)型 Chromosome

22、configuration 數(shù)量 Number 平均數(shù) Average 單價(jià)體Univalent 二價(jià)體Bivalent 三價(jià)體Trivalent 擬多價(jià)體Pseudo-multivalent 192 188 116 43 4.47 4.37 2.70 1.00 注：觀察總細(xì)胞數(shù)43個(gè)。 Note：The total number of observed cell at diakinesis stage is 43. 細(xì)線期至粗線期，結(jié)球甘藍(lán)和大白菜來源的染色體相互纏繞在一起，形成幾個(gè)大小不一的染色體團(tuán)，2 3個(gè)25S rDNA-FISH信號(hào)聚集分布在這些染色體團(tuán)上（圖2，A）。雙線期，染色體

23、逐漸縮短分散（圖2，B）。終變期，染色體的構(gòu)型表現(xiàn)出多樣性，有單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體（圖2，C E），其中以含有3個(gè)三價(jià)體和4個(gè)二價(jià)體的細(xì)胞所占比例最多。25S rDNA-FISH結(jié)果分析表明，大白菜5個(gè)含有25S rDNA位點(diǎn)的染色體中，其中兩個(gè)與結(jié)球甘藍(lán)染色體的同源程度較低，常以單價(jià)體的形式存在（圖2，D、E）；1個(gè)與結(jié)球甘藍(lán)1對(duì)同源染色體具有非常高的同源性，常以三價(jià)體的形式存在（圖2，E）；還有2個(gè)具有雜交信號(hào)的染色體往往和結(jié)球甘藍(lán)的1 3個(gè)二價(jià)體重疊或緊挨在一起形成擬多價(jià)體（Cockerham & Galletta，1976；莊東紅和石田雅士，2000）（圖2，D），說明這些染

24、色體間存在一定程度的同源性。平均每個(gè)細(xì)胞中的單價(jià)體、二價(jià)體、三價(jià)體和擬多價(jià)體分別約為4.47、4.37、2.70和1.00個(gè)（表1）。 中期，大多數(shù)細(xì)胞中多價(jià)體解離為二價(jià)體和單價(jià)體，二價(jià)體排列在赤道板上，單價(jià)體游離于赤道板周圍（圖2，F(xiàn)），數(shù)量1 7條不等，以4 6條居多，約占細(xì)胞總數(shù)的69.4%（表2），也有少數(shù)細(xì)胞中存在二價(jià)體游離于赤道板周圍的現(xiàn)象（圖2，G）。 后期，二價(jià)體正常分離移向細(xì)胞兩極，單價(jià)體或隨機(jī)到達(dá)一極或成為落后染色體（圖2，H、I），此外還見有兩條染色單體提前分開等現(xiàn)象（圖2，H）。后期兩極染色體數(shù)多樣，有兩極染色體數(shù)之和為28條的（如13/15、12/16、14/14、1

25、1/17），也有兩極染色體數(shù)之和不等于28條的（如13/14、10/17、16/13）（圖2，J L），其中以13/15方式分離的所占比率最高，約為30.77%（表3）。大多數(shù)細(xì)胞中能夠檢出9個(gè)雜交信號(hào)，分離方式有4/5、6/3等。 中期，兩組染色體分別排列在各自的赤道板上，多數(shù)細(xì)胞中含有游離于赤道板外的染色體（圖2，M）；后期，每極的染色體數(shù)有10 19不等（圖2，N、O），同時(shí)也有落后染色體的存在，致使四分體時(shí)期7.5%的細(xì)胞中出現(xiàn)了微核（圖2，P）。 2406 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 圖2 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）基于25S rDNA的FISH分析 A：粗線期，箭頭示25S r

26、DNA信號(hào)；B：雙線期；C：終變期早期；D：終變期，有柄箭頭示擬多價(jià)體，無柄箭頭示有信號(hào)單價(jià)體； E：終變期，有柄箭頭示三價(jià)體，無柄箭頭示有信號(hào)染色體；F：中期，示游離染色體；G：中期，箭頭示游離二價(jià)體； H：后期，無柄箭頭示落后單價(jià)體，有柄箭頭示落后二價(jià)體染色體，雙箭頭示染色單體提前分離； I：后期，箭頭示落后染色體；J：后期，示13/15分離；K：后期，示13/16分離； L：后期，示15/15分離；M：中期；N：后期，示13/13/14/15分離； O：后期，示10/12/17/17分離； P：末期，箭頭示微核。 Fig. 2 FISH analysis based on 25S rDN

27、A probe of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid（ACC） A：Pachytene，the arrow showing 25S rDNA signals；B：Diplotene；C：Earlier diakinesis；D：Diakinesis，the arrow with handle showing pseudo multivalents，the arrows without handle showing univalents with signals；E：Diakinesis，the arrow with handle showing

28、 tritivalents，the arrows without handle showing univalents with signals；F：Metaphase，showing containing dissociated univalents；G：Metaphase，the arrow showing dissociated bivalent；H：Anaphase，the arrow without handle showing lagged univalent，the arrow with handle showing lagged bivalent， the double arro

29、w showing separated chromatids；I：Anaphase，the arrow showing lagged univalent； J：Anaphase，showing 13/15 separation；K：Anaphase，showing 13/16 separation； L：Anaphase，showing 15/15 separation；M：Metaphase；N：Anaphase， showing 13/13/14/15 separation；O：Anaphase，showing 10/12/17/17 separations； P：Telophase，th

30、e arrow showing micronucleus. 12期 軒淑欣等：大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）基于25S rDNA的FISH分析 2407 表2 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體中期游離 單價(jià)體數(shù)及細(xì)胞比率 Table 2 Dissociated univalent number and cell percentage of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid at metaphase 游離單價(jià)體數(shù) No. of dissociated univalents 細(xì)胞數(shù) No. of cells 所占比率/% Percentage 1 4 6

31、.78 2 5 8.48 3 5 8.48 4 13 22.03 5 19 32.20 6 9 15.25 7 4 6.78 注：觀察總細(xì)胞數(shù)59個(gè)。 Note：The total number of observed cell at metaphasestage is 59.表3 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體后期的染色體 分離方式及細(xì)胞比率 Table 3 Chromosome distribution way and cell percentage of Chinese cabbagehead cabbage allotriploid at anaphase 染色體分離方式 Chromosom

32、e distribution way 細(xì)胞數(shù) No. of cells 所占比率/% Percentage 9/19 2 1.40 10/18 2 1.40 11/17 13 9.09 12/16 25 17.48 13/15 44 30.77 14/14 14 9.79 其它Others 43 30.07 注：觀察總細(xì)胞數(shù)143個(gè)。 Note：The total number of observed cell at anaphasestage is 143. 2.3 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體的花粉特性 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體能正常開花散粉，每個(gè)花藥內(nèi)平均有1.07 × 105個(gè)花

33、粉粒，與大白菜沒有顯著差異，但大多為空癟或畸形的，整齊度為42.6%，花粉生活力僅為15.9%，極顯著低于其二倍體親本（表4）。說明異源三倍體的花粉母細(xì)胞大多能完成減數(shù)分裂和配子形成過程，其花粉生活力的喪失可能主要是染色體數(shù)和組成不均衡所致。 表4 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體的花粉特性 Table 4 Characters of pollen grains in Chinese cabbagehead cabbage allotriploid 株系 Plants 花粉量/（個(gè) · 花蕾-1） Amount of pollen（No. · bud-1） 花粉整齊度/% Poll

34、en regularity 花粉生活力/% Pollen viability 異源三倍體 Allotriploid 1.07 × 105 bB 42.6 cC 15.9 cC 2x結(jié)球甘藍(lán) 2x head cabbage 1.40 × 104 aA 89.2 bB 75.0 bB 2x大白菜 2x Chinese cabbage 1.14 × 105 bB 91.4 aA 88.4 aA 2.4 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體的結(jié)實(shí)性 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體自交或與二倍體結(jié)球甘藍(lán)回交，授粉后大多子房都能夠膨大生長(zhǎng)，具有很高的結(jié)莢率，但結(jié)籽率極低，花期自交或回交均未得到

35、種子，蕾期自交或回交的結(jié)籽率僅為0.01%左右（表5），這對(duì)該異源三倍體的進(jìn)一步應(yīng)用造成了一定困難。 表5 大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體結(jié)莢率與結(jié)籽率 Table 5 The rate of pod and seed settings for Chinese cabbagehead cabbage allotriploid 授粉時(shí)期及類型 Pollination period and type 授粉花數(shù) No. of pollinated flowers坐莢數(shù) No. of pods 子粒數(shù) No. of seeds結(jié)莢率/% Pod setting rate 結(jié)籽率/% Seed setting

36、 rate 蕾期回交Backcross at bud stage 3 986 3 915 14 98 0.01 蕾期自交Selfing at bud stage 3 582 3 524 17 98 0.01 花期回交Backcross at flower stage 983 917 0 95 0 花期自交Selfing at flower stage 536 442 0 82 0 3 討論 異源三倍體是進(jìn)行異附加系或異代換系創(chuàng)建的關(guān)鍵材料。大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（ACC）的合成，從理論上講不僅為蕓薹屬提供了新種質(zhì)，而且為在1個(gè)細(xì)胞內(nèi)研究A、C基因組不同染色體間的同源性及互作和表達(dá)關(guān)系提供了基

37、礎(chǔ)材料。大量研究表明，蕓薹屬A、C基因組染色體間具 2408 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 有較高的同源性（Attia & Robbelen，1986；Schmidt et al.，2001；Kaneko et al.，2002；李宗蕓 等，2002；郄麗娟 等，2007）。本研究中通過觀察大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體雜種在減數(shù)分裂期間染色體的行為，可以看出這兩個(gè)物種間的親緣關(guān)系較近：前期早期，結(jié)球甘藍(lán)來源的兩套C染色體組和大白菜來源的1套A染色體組相互纏繞在一起并沒有出現(xiàn)分組現(xiàn)象；終變期，A組染色體并不完全以單價(jià)體形式存在，而是部分與C組染色體形成三價(jià)體或擬多價(jià)體。顧愛俠等（2006）在大白菜

38、結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體（AAC）中觀察到1 5個(gè)三價(jià)體，以形成3 4個(gè)為主。劉煒等（2008）在對(duì)兩個(gè)單體異附加系中也發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)附加系在終變期形成較高頻率的異源三價(jià)體，而另一個(gè)附加染色體則多以單價(jià)體的形式存在。這說明A、C兩個(gè)基因組不同染色體間的同源程度不同。本研究中觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，終變期大多數(shù)細(xì)胞中可觀察到3個(gè)三價(jià)體和4個(gè)單價(jià)體，這表明A基因組有3條染色體與C基因組染色體具有較高的同源性，有4條染色體與C基因組染色體的同源程度較低?！皵M多價(jià)體”是幾個(gè)二價(jià)體“次級(jí)配對(duì)”形成的聚合體，是在多倍體植物減數(shù)第1次分裂中期時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象，在柿樹減數(shù)分裂和Vaccinium的多倍體種中有過報(bào)道（Cocke

39、rham & Galletta，1976；莊東紅和石田雅士，2000）。此外，蕓薹屬基因組內(nèi)部各個(gè)染色體間也存在很高的同源性，也有報(bào)道可以發(fā)生“自體配對(duì)”（Armstrong & Keller，1981，1982；Choudhary & Joshi，2001）。本研究所觀察到的大白菜來源的兩條染色體與結(jié)球甘藍(lán)來源的1 3個(gè)二價(jià)體聚合形成的“擬多價(jià)體”，揭示了這些染色體間存在著一定程度的同源性，可能發(fā)生了“自體配對(duì)”及“次級(jí)配對(duì)”。 近年來利用基因組原位雜交（Genome in situ hybridization，GISH）技術(shù)進(jìn)行雜種鑒定的報(bào)道很多（Wei et al

40、.，2006；Ge & Li，2007；喬海云 等，2009）。然而，利用GISH 技術(shù)進(jìn)行雜種鑒定，親本的基因組必須分化到一定的程度才能將雜種中不同親本的基因組區(qū)分開來。由于蕓薹屬A、C基因組的同源程度很高，大白菜和結(jié)球甘藍(lán)染色體較小且形態(tài)相近，GISH技術(shù)在蕓薹屬A、C基因組雜種鑒定中存在一定難度（李宗蕓 等，2002；郄麗娟 等，2007）。而利用rDNA 進(jìn)行染色體FISH，由于大白菜和結(jié)球甘藍(lán)rDNA位點(diǎn)不同，因此可以在雜種中反映出來。本研究中，利用25S rDNA-FISH 對(duì)大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體染色體組成進(jìn)行了區(qū)分，揭示了A、C基因組不同染色體間存在不同程度的同源性。

41、然而，受rDNA位點(diǎn)僅存在于部分染色體及減數(shù)分裂期染色體形態(tài)難以區(qū)分所限，不能明確揭示具體染色體間的同源關(guān)系。 由于大白菜結(jié)球甘藍(lán)異源三倍體中包含了來自兩個(gè)親本的3個(gè)不同染色體組，在減數(shù)分裂中染色體不能正常配對(duì)分離，導(dǎo)致四分體時(shí)期各分體基本遺傳物質(zhì)的不平衡或丟失，致使形成的正常的有生活力的花粉粒所占比例極低。由此可以推測(cè)其大孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂行為也必然存在著復(fù)雜的異?，F(xiàn)象，其結(jié)果必定產(chǎn)生大量的無生活力的大孢子，從而表現(xiàn)在其自交或與結(jié)球甘藍(lán)回交中存在著嚴(yán)重的不稔現(xiàn)象，使得結(jié)籽率極低，為進(jìn)一步利用其創(chuàng)建異附加系帶來很大困難。 References Akaba M，Kaneko Y，Hatakey

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