CTAB--硅珠法提取DNA實驗操作

1、前言:實驗足要求殊纟產(chǎn)後的過程，每個一步驟都可滋對后曲的操作產(chǎn)唆很丈影響，73至彫響 后面的豬果，一步籍，步步籍，每一個燥作的失誤都可飩導(dǎo)致整個實驗的失氏事實朮是鳥臘緒實實的作風(fēng)是每個做實臉的人必備翁屋涼品質(zhì)，永迄杞住，代何弄疾作 假的行簽都足可恥的，在運個充滿禽術(shù)扁畋的科禽界保持自己的絶命謹記1 材料的采集釆取植物的嫩葉,可以用硅膠干燥保存，也可以用冰袋,主要是防止葉片組織的降解及葉片的褐化.用 泡沫塑料箱子帶回，置于-70°c冰箱保存.2.ctab硅珠凍提取dna賣殮流程各加入液體的配制：1、ctab提取液：2% (w/v g/mol ) ctab；5% (w/v g/mol)

2、pvp：1.4mol/lnacl；20mmol/l edta ph=8.()；100mmol/l tris-hcl ph=8.0；2%(v/v)藐基乙醇(臨吋加入)配制量：500ml配制方法：(1)計算所需組分量ctab10g需熱磁力攪拌pvp25gnacl40.908gedta.na2.2h2o3.7224g調(diào)ph=8冷卻為常溫時(母液)tris6.057g(2)稱取 ctab 10g, nacl 40.908g, pvp25g 置于 500ml 燒杯中 加入約300dd出0(雙蒸水)充分磁力攪拌溶解(注意：edta和pvp較難溶，加熱溶解的同時用熱磁力攪拌直至完全的透明為止)(4) 量取

3、20mledta(0.5mol/l ph=8 ), 50ml tris-hcl(l mol/1 ph=8)溶液于燒杯中，均勻混合(5) 將燒杯溶液定容至500ml后，高溫高壓滅菌(6) 室溫保存。0.5mol/ledta 配制組分濃度：o.5mol/1edta, ph=8配制量：500ml配制方法(1)稱取93.06克edta.na2.2h2o,置于500 ml燒杯中(2) 加入約400ml dd出0.用熱磁力攪拌器充分攪拌(3) 用naoh調(diào)節(jié)ph值到8,約用10克固體naoh(4) 在溶液冷卻后，再用naoh調(diào)節(jié)至ph=8(5) 加dd h2o將溶液定容到500 ml(6) imj溫咼壓滅

4、菌后，室溫保存naoh溶液的配制組分濃度：5 mol/1 naoh配制量：100 ml配制方法(1)稱取固體naoh 20克于容器中(2) 加入dd h2o定容到100 ml100 mmol/1 tris-hcl 的配制組分濃度： mmol/1 tris-hcl, ph=6.4配制量：250 ml配制方法稱取3.025克tris于250 ml燒杯中.(2) 加入約200ml dd h2o充分攪拌溶解.(3) 用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值到6.4.所用濃鹽酸約3 ml(4) 將溶液定容至250ml(5) 用棕色瓶分裝于4度冰箱中(6) 如使用，用水浴加熱溶解.2、氯仿異戊醇的配制：配制方法(1)簡單的體積

5、混合，既要求比例為24： 1即可(2) 儲存于棕色玻璃瓶子中(3) 置于4度冰箱以便口后使用3總的賣殮流程3.總的dna的提?。?. 在10ml離心管(eppendorf管)中加入4mlctab提取液及80ul 基乙醇，在65°c水浴鍋中預(yù)熱2. 取材料1-2g于研缽中，加入適量液氮迅速多次研磨成細粉狀，轉(zhuǎn)至預(yù)熱的ctab提取液中，用封 口膜將離心管封密以防止疏基乙醇揮發(fā)放回水浴屮保溫30分鐘，保溫過程屮輕晃兒次，保持搖 勻.3. 取出eppenedorf管.置于冰上迅速冷卻到室溫，加入等體積的4ml氯仿-異戊醇(24： 1),輕微混 合均勻且充分，使其徹底地混合成乳狀液，然后4&#

6、176;c下離心12000rpm lomin,輕輕將上清液吸取 lml于1. 5ml離心管,放于-20°c冰箱中備用.各加入液的用途：(1) 去污劑：ctab：可將細胞膜裂解，使dna釋放到提取液中，同吋也使組織勻漿中的蛋白質(zhì)變性.edta：能與dnase的輔助因子結(jié)合，使dnase失去活性，不能降解從細胞中釋放的dma.(2) 還原劑疏基乙醇：它抑制從細胞屮釋放的多酚氧仿.防止植物組織發(fā)黃變褐.(3) 氯仿一異戊醇：它可把組織勻漿屮變性的蛋白質(zhì)除去，將d7a與細胞屮的蛋白質(zhì)、碳水化合物等分開除去.(4) rnase：它可去除核酸中的rna,只留下dna.3.2.總dna的純化操作步

7、驟：1. 取出1.5ml離心管，內(nèi)含所取dna,加入looul硅珠懸浮液(此液要求先行渦旋再使用)，使用渦 旋振蕩器大約15s,使之充分混勻，于室溫靜置10分鐘，再振蕩5秒，后離心：8000rpm 15s 4 度，去除上清液得到硅珠一一核酸復(fù)合物.2. 將復(fù)合物用鍛子一次打兩個，打成液狀，使之完全分散，加入漂洗液lml,再渦旋充分混勻，后離 心8000rpm 15s棄掉上清液.3. 重復(fù)上一步一次.4. 用70%的lml乙醇將硅珠一一核酸復(fù)合物漂洗兩次.每次渦旋充分混勻后，離心8000rpm 15s,棄 上清液，打散，最后用lml無水乙醇再漂洗一次，用渦旋混勻離心8000rpm 15s,然后將

8、離心管管 口打開倒置在吸水紙上，再將沉淀置于真空冷凍干燥機中風(fēng)干復(fù)合物10分鐘.5. 加入looulte緩沖液充分混勻后，于56度水浴中保溫10分鐘，然后離心12000rpm 5min.取上清 液即為所需的dna.6. 將余下的復(fù)合物再次完全打散(即渦旋)，加入looulte緩沖液進行第二次重旋，并于56度水浴 屮保溫lomin, 12000rpm 5min,取上清液于步驟5管屮共存.7. 將兩次二合一的上清液離心混勻14000rpin lomin ,取上清液存于-20冰箱中. 儀器的使用真空干燥器：在使用前要求先預(yù)熱30分鐘，只打開1號閥門.打開蓋子平衡放入離心管，然后順次開啟2號一一3號一

9、一4號一一5號門.進行干燥處理5分鐘. 關(guān)閉各閥門.順序為5號一一4號一一3號一一2號一一1號閥門.各加入液的配制1、硅珠懸浮液的配制(1) 稱取1.2g硅珠粉，溶解于10ml無菌水中.(2) 放入4°c冰箱備用.(3) 使用時先渦旋使其混合均勻.2、漂洗液的配制稱取guscn (可能產(chǎn)生有毒氣體，要求在通風(fēng)櫥中進行)120克溶解于100mltris-hcl(100nimph6. 4)中. 要求在60°c水浴中溶解.3、te緩沖液的配制10xte, 500ml配制如下：將 100mm tris-hcl (ph=8. 0) 6. 057g 與 lomm edta (ph=8.

10、 0) 1. 8612g 溶于 400ddh20 中，調(diào) ph=8. 0, 定容到500ml o3.3.dna樣濃度、純度測定取4ul dna水溶液用雙蒸水稀釋到400ul,用紫外分光光度計測定其d230nm. d260nm. d280nm值. 根據(jù)d260nm值估測濃度。根據(jù)d260nm/d230nm> d260nm/d280nm值估測其純度.(1) 濃度計算公式：對于雙鏈dna而言d260nm為50ug/mldna樣品的濃度(ug/ml) = d260nmx稀釋倍數(shù)x 50/1000(2) 純度估測標準：純的 dna 溶液其 d260nm/d280nm=l. & d260nm

11、/d230nm >2.0dna濃度的精確測定：去除一定量的dna,稀釋成200ug/ul,配制少量400、200、100和50 ng的xdna.取標準入dna 和樣品各lul,進行0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳.紫外燈下比較樣品dna條帶的亮度，并對dna樣品進行 定量、調(diào)整樣品的dna的量與100昭x dna的亮度相一致.總的dna跑出來條帶在紫外光下看應(yīng)該是明亮的一條，沒有拖尾的現(xiàn)象,若有的話可能dna部分降 解或提純的不徹底,含有的rna較多.雖然ssk對模板的要求不是太嚴格，具體能否擴岀條帶，還須實 驗證明，或重新提取.2.pcr護增ssr-pcr擴增反應(yīng)體系1、10ul反應(yīng)體系：調(diào)

12、溫咼壓滅菌水h2o5. 45ul5. 45ulxa5. 45ulxaxb10x bufferlullul xalulxaxb2mm-dntplullul x alul xaxb25mu-mgc12lullul xalul xaxbr-taq0. 05ul0. 05uxa 10. 05ulaxbprimer+0. 25ul0. 25ulxa0. 25ulxaxbprimer-0. 25ul0. 25ul xa0. 25ulxaxbdna模板lul說明：a個反應(yīng)量二不同模板n+2, b為引物數(shù)+22、作程序及其注意事項：1）分裝各型槍頭.2）分裝各型離心管.3）順次用碳筆標明引物號，小master

13、順序號及總master順序號.、4）收取冰塊半盤，將取出各液放于冰上.5）配總master,先計算好axb6）d-ntp和mgcb要求加樣前先輕微渦旋混勻，taq酶要求在冰箱口取用.7）配 master 的順序：也0bufferdntpmgcltaq8）輕渦旋總master9）分裝c個引物個小master10）向c個小master加入c個引物11）將含引物的c個master渦旋混勻 將n個模版點加到nxc個小離心管中，各含luldna13）將各小master,每9ul加入到含luldna的離心管中14）時刻注意更換槍頭，防止交叉感染，盡量不要將槍頭放在液面下. 將擴增好的d"a進行浪

14、酚藍點樣，每離心管8ul3、各加入液的配制（1）引物的稀釋1）每管引物先looorpm 3min進行離心，將附在管壁上的粉末或膜狀物離心到底部，小心打開蓋子.2）加入經(jīng)高溫高壓的滅菌水.針對不同的引物加入不同的量3）使最終濃度都為10um/l（2）溟酚藍的配制1）將0. 125克澳酚藍，20克蔗糖溶解為50ml的ddh.o2）再進行過濾3）放于4°c冰箱中儲存（3）buffer的配制1）1xte buffer組成濃度：lomm tris-hcl imm edta ph二& 0配制量：500ml配制方法：量取下列溶液于500ml燒杯中im tris-hcl buffer ph=

15、8.05m10. 5m edtaph二8.0lml向燒杯中加入約400mldd h20均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存.2）10xte buffer組成濃度：100mm tris-licl 10mm edtaph二8. 0配制量：1000ml配制方法：量取下列溶液于1升燒杯中：im tris-hcl buffer ph=8.0100ml；0. 5m edtaph二8. 0 20ml向燒杯中加入約800mldd h2o均勻混合；將溶液定容到1升后，高溫高壓滅菌；室溫保存.imtris-hcl 的配制：組分濃度：im ph=7.4 7.6 8.0配制量：500ml配制方法

16、：稱取6.057克tris置于500ml燒杯屮；加入約400ml的ddhzo充分攪拌溶解；按下表量加 入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需ph值ph值濃鹽酸量7.435ml7.630ml&021ml將溶液定容到500ml；高溫高壓滅菌后，室溫保存.pcr反應(yīng)體系1、本實驗樣品所采用的反應(yīng)程序：2、pcr擴增儀的操作：1）先通過觀察哪個指示燈是空的擴增儀2）右旋打開蓋子，按順序擺放并用手柄輪壓實3）做旋蓋好蓋子至刻度處4）打開操作程序，選好人名反應(yīng)體系并逐一確定5）掌握擴增儀時間2:30降溫需30分鐘聚丙烯酰胺凝膠電泳pagepage操作流程及注意事項：1、涂膠1）將有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化劑中，新液2

17、5分鐘，舊液30分鐘.2）涂無耳正面玻片硅化劑.均勻點四滴，輕而勻的沿一個方向涂三次，靜10分鐘.3）到時間取出.打開通風(fēng)櫥風(fēng)干30分鐘.2、封膠1）將兩玻片對貼于橡膠框中，放平，用力擰死，夾住橡膠管.2）溶廢瓊脂膠，分兩次：第一次50秒，第二次10-20秒，防止沸出.3）用小細長槍頭通透加膠槍頭，便于加樣通暢，少起氣泡.4）吸2500-3000u 1液膠加速沿玻片邊緣快速順下滴，將兩面玻片充分封死，防止漏膠.以水平底線面水平高于底為佳，靜止凝膠15分鐘（有時可先在封口加一點tbe以潤滑玻片，利于膠流下）3、灌膠1）用長細槍頭透開加膠槍頭2）從中間加入，每次不要全部打完，留一點在槍頭內(nèi).防止斷

18、流而導(dǎo)致膠中含有氣泡.3）插梳子時兩端平整，梳子緊貼玻板，梳齒頭部不可有氣泡.4）拔梳子時先加一倍tbe液將梳子泡透，然后平行用力拔出.5）在插梳子15分鐘內(nèi)跟蹤觀察，適當下按，保證孔的深度.6）等待2小時，以便膠充分凝固.4、吹孔1）向中間槽加入1倍粗制tbe,要淹沒過內(nèi)玻片約1厘米.2）拔梳子，小心平穩(wěn)，均勻平衡.3）調(diào)looop槍到300-600u1,進行吹孔,將小孔內(nèi)沉淀物吹打干凈，加樣中再視時吹孔.5、加樣1）用細長專用槍加入dna 0. 5ul.2）一手托另一臂的肘，以保證加樣手不抖.3）一定垂直加到孔中去，不脫尾，不吸水，不靠壁，干凈利落.4）加完一次.在放于桌旁的吸紙上，將細槍

19、頭上余液吸干.5）首、中、尾各留1到2個孔，兩面膠孔的marker不完全一樣，以便區(qū)分.6）加marker 0. 15ul 一般収0. 3ul每孔注如一半，可用兩個孔.6、跑膠1）向兩側(cè)槽中加入粗制tbe,至u管線處.2）打開電源，穩(wěn)壓到120v3）電泳2h左右4）當樣品跑到底部2cm處，關(guān)閉電源.7、撬玻片1）刀片不伸入過深刀片平行于玻片，稍用力.2）將沒有硅化劑的無耳玻片放于水盤中，還有梳子.3）清理瓊脂膠，放于燒杯中.4）膠玻片放于盤中，銀染.各加入液的配制1、反硅化劑的配制1）量取 500ml ddh2o.2）用冰乙酸把ddfw ph調(diào)至3. 5.3）再加 bind-s訂ica2ml.4）用熱磁力攪拌器攪拌均勻.2、tbe電泳母液（10x）的配制1）分別稱取 54 克 tris 堿,27.5 克硼酸,20ml 0. 5mol/edta （ph=8.0）2）將各組分別加入1升燒杯中，用ddh2o定容到1升.3）在電泳吋使用1倍工作液，按1： 4與水混合.4）1倍液是為了增加電泳工作液的電流的電流量.5）盛于玻璃瓶