低溫凍存HABMSCs修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

1、低溫凍存habmscs修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研宄王富強(qiáng)張繼波孔令菊劉建生鄭德宇(遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室遼寧錦州12 1001)【摘要】目的：通過深低溫凍存自行構(gòu)建的人工植骨材料多孔羥基磷灰石 (hydroxyapatite ceramic, ha)/ 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,bmscs)修復(fù)兔頻骨缺損，探討深低溫凍存 (cryopreservation)方法對(duì)保存ha復(fù)合植骨材料的可行性，以方便臨床使用。方 法：應(yīng)用無(wú)菌培養(yǎng)法獲得bmscs與羥基磷灰石ha復(fù)合培養(yǎng)，獲得復(fù)合植骨材 料培養(yǎng)構(gòu)成人工植骨材料。應(yīng)用-80&#

2、176;c保存3個(gè)只的ha/bmscs修復(fù)兔顱骨 12mm缺損模型，同時(shí)以未行低溫凍存的ha/bmscs及單純的ha分別為對(duì)照 組1和2。在術(shù)后第12周進(jìn)行大體觀察、x線觀察和he染色等組織學(xué)觀察。 結(jié)果：bmscs與多孔ha構(gòu)建出人工植骨材料，bmscs在ha表面生存良好。 三組模型在術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照1組的骨缺損處愈合大部，有成熟骨小梁通 過，有的可見髓腔通暢，塑形較好；對(duì)照2組骨痂生成少，骨缺損部分愈合， 塑形欠佳，新骨生成有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值<0.05)。結(jié)論：低溫凍存的復(fù)合植骨 材料的骨缺損修復(fù)能力與新制作的復(fù)合材料幾乎一致，沒有因?yàn)閮龃娑艿接绊憽?【關(guān)鍵詞】骨髓間

3、充質(zhì)干細(xì)胞羥基磷灰石支架材料復(fù)合物低溫凍存顱骨缺損 【中圖分類號(hào)】r322-33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】2095-1752(2012)08-0392-03刖目臨床上，創(chuàng)傷、腫瘤以及感染等疾患引起的大塊骨缺損相當(dāng)普遍，骨缺 損的治療一直是骨科難題之一1-2,國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛的實(shí)研宄與臨床實(shí)踐。 異種、同種異體、自體及人工合成物質(zhì)作為修復(fù)材料在免疫排斥、材料來(lái)源、醫(yī) 學(xué)倫理及繼發(fā)感染等方面的問題目前尚難消除另3。應(yīng)用組織工程的方法構(gòu)建 人工植骨材料是修復(fù)大面積骨缺損的有效方法，但是根據(jù)骨組織工程方法，從設(shè) 計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)等到最后獲得組織工程骨需要復(fù)雜的過程，體外構(gòu)建需要一定的時(shí)間，不能滿足臨

4、床上即刻應(yīng)用骨缺損修復(fù)的要求4-5】。同吋，隨著組織工程研究 的深入，組織工程產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化、市場(chǎng)化的需要使其保存也成為新的研究課題, 探索標(biāo)準(zhǔn)化的保存方法，研究組織工程骨的冇效保存技術(shù)對(duì)于組織工程開發(fā)和臨 床應(yīng)用至關(guān)重要6-8。在以往的研究中，奮低溫保存顱骨骨瓣修復(fù)顱骨缺損獲得 成功的報(bào)道9】。本研究擬低溫保存自行構(gòu)建的輕基磷灰石（hydroxyapatite，ha）/ 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derivedmesenchyaml stem cell, bmscs）修復(fù)兔盧頁(yè) 骨缺損，探討深低溫凍存下的ha支架材料復(fù)合物修復(fù)骨缺損的能力以及深低 溫保存支架材料復(fù)合物的可行性。

5、1.實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白乳兔5只，健康2月齡日本大耳白兔18只， 體重2kg，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)無(wú)菌條件下從1日齡健康乳兔 股骨和脛骨中分離培養(yǎng)bmscs，用完全培養(yǎng)基（青霉素200u/ml,鏈霉素 200mg/mg,dmem,15%fbs）沖洗減去兩端骨骺的骨干，所得沖洗液1200r/min離 心10分鐘，吸棄上清，所得細(xì)胞沉淀以l×106/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中, 于37°c、5% c 02條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，72小吋半量換液，以后每2天換液 一次。待細(xì)胞相互融合達(dá)80

6、%生長(zhǎng)面積吋用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行第一次傳代培 養(yǎng)。1.2.2復(fù)合植骨材料的構(gòu)建取106個(gè)bmscs,約lm i與預(yù)先用dmem培養(yǎng)液中浸泡24h后的無(wú)菌ha柱（直徑1.2cm,厚約2mm）共培養(yǎng)7天。 應(yīng)用掃描電鏡觀察bmscs在ha表面的形態(tài)、生長(zhǎng)狀況及膠原分泌情況。1.2.3復(fù)合植骨材料的凍存與復(fù)蘇將培養(yǎng)1周的支架材料復(fù)合物移入含冇dmem保存液（10%dmso, 20% fbs的dmem培養(yǎng)基）的凍存管中，于4°c環(huán)境預(yù)冷lh后，將凍存管置于-80°c冰箱中保存3個(gè)月。3個(gè)月后，取出 凍存管，快速置于37°c水浴箱中快速?gòu)?fù)溫至保存液完全融化，置于37&#

7、176;c、5%co2 飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。將部分標(biāo)本應(yīng)用掃描電鏡觀察bmscs在ha表面的形態(tài)、生長(zhǎng)狀況。1.2.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及復(fù)合支架移植 在無(wú)菌條件下分別應(yīng)用凍存后 的復(fù)合材料（實(shí)驗(yàn)組）、新制備的復(fù)合材料（對(duì)照1組）和單純ha （對(duì)照2組） 修復(fù)兔顱骨1.2cm缺損。術(shù)后前3天，連續(xù)肌注青霉素80萬(wàn)單位/天，分二 次注射。術(shù)后12周處死動(dòng)物，并進(jìn)行大體觀察、x 線檢測(cè)和he染色檢測(cè)骨 缺損修復(fù)水平。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spss16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)x-&plusmn;s標(biāo) 準(zhǔn)差表示；組間計(jì)量資料行配對(duì)t檢驗(yàn)，p < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果2.1原代bmsc的培養(yǎng)原來(lái)培養(yǎng)的bmscs在接種的前3天，并沒冇明顯的細(xì)胞貼壁，從第4 天開始，在培養(yǎng)瓶的底部能看到一些多角形的細(xì)胞或分散存在或聚在一起（圖 1a）。此后的一周內(nèi)，細(xì)胞的數(shù)量開始逐漸增加，直到14左右，細(xì)胞相互融合 到一起，多平行排列，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形（圖ib）。bmscs傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度 較原代培養(yǎng)快，大約在8天左右能達(dá)到80%融合。圖1原代培養(yǎng)的bmscsa:原代培養(yǎng)第4天，可見細(xì)胞呈多角形散在分布在培養(yǎng)瓶底部。b: 原代培養(yǎng)第14天，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，平行排列。2.2 ha復(fù)合成骨誘導(dǎo)后bmscs構(gòu)成的復(fù)合植骨材料應(yīng)用成骨誘導(dǎo)的 bmscs與多孔ha共培養(yǎng)7天后,掃

9、描電位觀察bmscs在ha表面的生長(zhǎng)狀態(tài)。 在多孔ha的表面，可見bmscs伸出了突起，相互接觸，彼此連接成片，有的 細(xì)胞己經(jīng)伸入到ha的孔隙內(nèi)。在部分bmscs之間有絲狀纖維連接，在細(xì)胞表 面也可見到有大小不等的ft色鈣質(zhì)顆粒（2a）。復(fù)合植骨材料凍存并復(fù)蘇后，多 孔ha的表面及孔隙內(nèi)的bmscs的狀態(tài)與凍存前并沒有明顯的區(qū)別，細(xì)胞也沒 有從ha表面脫落的趨勢(shì)（2b）。圖2 ha和bmscs構(gòu)成的植骨材料a: bmscs與ha復(fù)合培養(yǎng)7天， bmscs在ha表面生長(zhǎng)狀態(tài)良好，通過突起互相連接在一起，在細(xì)胞表面可見 到閂色的顆粒狀物質(zhì)。b: bmscs與ha復(fù)合培養(yǎng)7天，凍存3個(gè)月，復(fù)蘇后 培

10、養(yǎng)1天。bmscs在ha表面的生長(zhǎng)狀況良好，并沒有從ha表面脫落的趨勢(shì)。 細(xì)胞表面可見到散在的白色顆粒狀物質(zhì)。2.3復(fù)合材料原位成骨結(jié)果術(shù)后所有動(dòng)物全身狀況良好，正常進(jìn)食。切口無(wú)紅腫及滲出液，部分動(dòng) 物術(shù)區(qū)周圍有一定程度的腫脹，雖然未進(jìn)行特殊處理，這些腫脹也逐漸自行消退。 無(wú)動(dòng)物死亡的現(xiàn)象發(fā)生，所有動(dòng)物均計(jì)入實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。2.3.1大體觀察：手術(shù)后第12周：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照1組植骨材料完全被 骨樣組織包裹，并形成連續(xù)性骨痂，塑形較好。對(duì)照2組的支架材料與自體骨 間界限模糊，結(jié)合處被骨痂包繞，在某些植骨材料的表面多為纖維樣組織包裹。2.3.2 x線觀察 術(shù)后12周：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照1組可見支架材料大部 分已

11、經(jīng)與自體骨融合，只有少許的透光區(qū)；材料內(nèi)部的密度較周圍正常骨高，但 有些部位接近正常組織。有連續(xù)性骨樣組織通過斷端（見圖3a、b）;對(duì)照2組 材料與周圍顱骨的邊界仍較清楚，骨痂量少，塑形欠佳；支架內(nèi)部的密度明顯高 于周圍骨組織，說明改建不良，內(nèi)部的低密度透光區(qū)也較多，說明骨形成不良（見 圖 3c）。圖3術(shù)后12周的x線片a：實(shí)驗(yàn)組，植骨材料與骨缺損間連在一起，內(nèi)部出現(xiàn)透光區(qū)。b:對(duì) 照1組，植骨材料與周圍骨組織的密度相近，內(nèi)部奮透光區(qū)，骨痂樣結(jié)構(gòu)減少。 c：對(duì)照2組，植骨材料的界限仍然清晰可見，骨缺損的邊緣還有大量的骨痂樣 組織。2.3.3組織學(xué)觀察術(shù)后的所有吋間中，在材料周圍均未發(fā)現(xiàn)明顯的炎

12、性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。 術(shù)后12周：a組、b組支架材料與自體骨之間可見大量新生骨組織，冇規(guī)則骨小梁通過，局部可見有少量的皮質(zhì)骨形成，內(nèi)部可見小血管。c組支架材料與自 體骨間也見新生骨組織但較少且骨質(zhì)薄，中間的空隙多數(shù)為纖維結(jié)締組織相連, 近骨斷端側(cè)有骨小梁形成，但尚沒冇與h a表面的組織形成冇效的連接、貫通（圖4）。圖4術(shù)后12周植骨材料的he染色a：實(shí)驗(yàn)組，在復(fù)合植骨材料內(nèi)部可見有部分ha降解，內(nèi)部的骨島形 成增加，小血管常見偶見骨髓再生。b:對(duì)照1組，在植骨材料的內(nèi)部的新骨形 成，ha降解程度明顯，呈島狀包裹在新骨中，在骨質(zhì)中可見小血管和骨髓。c: 對(duì)照2組，在羥基磷灰石表面，薄層骨質(zhì)較8周吋

13、增厚，但仍未能充添整個(gè)縫 隙中，其余部分是纖纖維結(jié)締組織，ha內(nèi)部降解明顯增多。ha：羥基磷灰石，b:骨組織，f:纖維結(jié)締組織，v:小血管，m:骨 髓討論應(yīng)用自體骨是修復(fù)骨缺損的金指標(biāo)，但由于各種原因造成的人范圍的骨 缺損難以獲得足夠的自體骨缺損修復(fù)材料。應(yīng)用組織工程的方法可以獲得較理想 的骨缺損修復(fù)材料，但是從組織工程骨的設(shè)計(jì)到獲得能應(yīng)用的人工植骨材料需要 一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，不能滿足即刻應(yīng)用的目的10-12。所以部分研究者和臨床工作 者開始將目光轉(zhuǎn)向組織工程骨的保存上。雖然臨床上奮應(yīng)用凍存自體顱骨骨瓣修 復(fù)的報(bào)道，但對(duì)于組織工程骨的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明ha復(fù)合自 體的bmscs具冇

14、良好的骨缺損修復(fù)效果，但這種復(fù)合材料在凍存后是否還具冇 骨缺損修復(fù)效果也不清楚。本實(shí)驗(yàn)將骨缺損修復(fù)材料在一 80°c凍存3個(gè)月后, 應(yīng)用凍存后材料修復(fù)顱骨缺損，于術(shù)后12周，通過大體觀察，x 線檢測(cè)和h e染色的方法，可以初步證實(shí)凍存后的植骨材料的骨缺損修復(fù)效果與新構(gòu)建的植 骨材料的骨缺損修復(fù)效果相似，明顯優(yōu)于單純的ha的骨缺損修復(fù)效果。顱骨 的最大載荷結(jié)果也與上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，應(yīng)用凍存后的材料修復(fù)的顱骨的載荷 與新構(gòu)建的植骨材料一致?？梢姂?yīng)用低溫凍存方法可以簡(jiǎn)單有效的保存ha支架材料復(fù)合物，可以滿足臨床上即刻應(yīng)用的要求。低溫凍存技術(shù)的發(fā)展，在許多新的領(lǐng)域具奮很大的發(fā)展空間和潛力，

15、但也有許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)需要更深入的探討。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)深低溫凍存3個(gè)月的支架材 料復(fù)合物進(jìn)行初步研宄，延長(zhǎng)凍存吋間或者增加凍存保護(hù)劑或者改變凍存方式 (玻璃化凍存)，尹宏宇等13】實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于組織工程骨而言，玻璃化凍存是 更具有發(fā)展?jié)摿Φ纳畹蜏乇４娣椒?。藍(lán)旭14研究了凍存保護(hù)劑對(duì)低溫保存的 組織工程骨修復(fù)骨缺損的影響，發(fā)現(xiàn)選擇適宜的凍存保護(hù)劑對(duì)組織工程骨的生物 活性有一定的保護(hù)作用。隨著科學(xué)實(shí)驗(yàn)和技術(shù)的發(fā)展，研究各類細(xì)胞、組織、器 官的低溫耐受性和生物材料的傳熱規(guī)律的成熟，尋求減輕損傷的技術(shù)，最終會(huì)實(shí) 現(xiàn)器官的低溫保存15-16。參考文獻(xiàn)lsmartt jj, karmacharya j, gann

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