酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)技術(shù)研究ppt課件

1、酶反響動(dòng)力學(xué) 主要研討酶催化的反響速度以及影響反響速度的各種要素 在討論各種要素對(duì)酶促反響速度的影響時(shí)，通常測(cè)定其初始速度來(lái)代表酶促反響速度，即底物轉(zhuǎn)化量k+2k-1k+2時(shí)，時(shí)，Km=k-1/k+1=KsKm=k-1/k+1=Ks。 Km Km可用于判別反響級(jí)數(shù)：當(dāng)可用于判別反響級(jí)數(shù)：當(dāng)S0.01KmS100KmS100Km時(shí)，時(shí)，=Vmax=Vmax，反響為零級(jí)反響當(dāng)，反響為零級(jí)反響當(dāng)0.01KmS100Km0.01KmS100Km時(shí)，反響處于零級(jí)反響和一級(jí)時(shí)，反響處于零級(jí)反響和一級(jí)反響之間，為混合級(jí)反響反響之間，為混合級(jí)反響 關(guān)于Km和Vmax的意義有以下論述：KmKm是酶的特征性常數(shù)：

2、在一定條件下，某是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的種酶的KmKm值是恒定的，因此可以經(jīng)過(guò)測(cè)定值是恒定的，因此可以經(jīng)過(guò)測(cè)定不同酶特別是一組同工酶的不同酶特別是一組同工酶的KmKm值，來(lái)值，來(lái)判別能否為不同的酶判別能否為不同的酶 。KmKm可用來(lái)判別酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種可用來(lái)判別酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在時(shí)，不同的底物存在時(shí)，KmKm值最小者，為該酶值最小者，為該酶的最適底物的最適底物 關(guān)于Km和Vmax的意義有以下論述：KmKm可用來(lái)確定酶活性測(cè)定時(shí)所需的底物濃可用來(lái)確定酶活性測(cè)定時(shí)所需的底物濃度：當(dāng)度：當(dāng)S=10KmS=10Km時(shí)，時(shí)，=91%Vmax=91%Vmax，為

3、最適，為最適宜的測(cè)定酶活性所需的底物濃度。宜的測(cè)定酶活性所需的底物濃度。 VmaxVmax可用于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的計(jì)算：當(dāng)酶的總可用于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的計(jì)算：當(dāng)酶的總濃度和最大速度知時(shí)，可計(jì)算出酶的轉(zhuǎn)換濃度和最大速度知時(shí)，可計(jì)算出酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，即單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)數(shù)，即單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。酶的濃度對(duì)于反響速度的影響 當(dāng)反響系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶當(dāng)反響系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶促反響速度與酶濃度成正比，即促反響速度與酶濃度成正比，即=kE=kE。其他要素對(duì)于酶促反響速度的影響 普通來(lái)說(shuō)，酶促反響速度隨溫度的增高而普通來(lái)說(shuō)，酶促反響速度隨溫度的增

4、高而加快，但當(dāng)溫度添加到達(dá)某一點(diǎn)后，由于加快，但當(dāng)溫度添加到達(dá)某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反響速度迅速下降酶蛋白的熱變性作用，反響速度迅速下降 察看察看pHpH對(duì)酶促反響速度的影響，通常為一對(duì)酶促反響速度的影響，通常為一鐘形曲線，即鐘形曲線，即pHpH過(guò)高或過(guò)低均可導(dǎo)致酶催過(guò)高或過(guò)低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的pHpH值就稱為酶的最適值就稱為酶的最適pH pH 酶的抑制劑 定義：凡是能降低酶促反響速度，但不引定義：凡是能降低酶促反響速度，但不引起酶分子變性失活的物質(zhì)起酶分子變性失活的物質(zhì) 分類：不可逆抑制造用和可逆抑制造用分類：不可

5、逆抑制造用和可逆抑制造用 。不可逆抑制造用 定義：抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)定義：抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡(jiǎn)一方法使酶活性恢復(fù)的抑制造用簡(jiǎn)一方法使酶活性恢復(fù)的抑制造用 。 分類：酶的不可逆抑制造用包括專注性抑分類：酶的不可逆抑制造用包括專注性抑制如有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制和制如有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制和非專注性抑制如路易斯氣對(duì)巰基酶的抑非專注性抑制如路易斯氣對(duì)巰基酶的抑制兩種制兩種 ?？赡嬉种圃煊?定義：抑制劑以非共價(jià)鍵與酶分子可逆性定義：抑制劑以非共價(jià)鍵與酶分子可逆性結(jié)合呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等結(jié)合

6、呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等簡(jiǎn)一方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復(fù)簡(jiǎn)一方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復(fù)的抑制造用的抑制造用 。 分類：競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制分類：競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾種類型幾種類型 ?？赡嬉种圃煊?競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)與酶的同一活性競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低催化活性降低 特點(diǎn)：特點(diǎn)：a.a.競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產(chǎn)物；反響產(chǎn)物；b.b.抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶抑制劑與酶的結(jié)合部位與底

7、物與酶的結(jié)合部位一樣；的結(jié)合部位一樣；c.c.抑制劑濃度越大，那么抑制抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減??；造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減??；d.d.動(dòng)力學(xué)參數(shù)：動(dòng)力學(xué)參數(shù)：KmKm值增大，值增大，VmVm值不變。值不變。 可逆抑制造用 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑不能與游離酶結(jié)合反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與，但可與ESES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低使酶的催化活性降低 。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：a.a.抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合；部位結(jié)合；b.b.必需有底物存在，抑制劑才必需有底

8、物存在，抑制劑才干對(duì)酶產(chǎn)生抑制造用；干對(duì)酶產(chǎn)生抑制造用；c.c.動(dòng)力學(xué)參數(shù)：動(dòng)力學(xué)參數(shù)：KmKm減小，減小，VmVm降低。降低。 可逆抑制造用 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與可以與ESES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低 。 特點(diǎn)特點(diǎn):a.:a.底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合；相結(jié)合；b.b.抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改動(dòng)對(duì)抑制程度無(wú)影響；底物濃度的改動(dòng)對(duì)抑制程度無(wú)影響；c.c.動(dòng)力學(xué)參動(dòng)力學(xué)參數(shù)：數(shù)：KmKm值

9、不變，值不變，VmVm值降低值降低 酶的激活劑 定義：定義：KmKm值不變，值不變，VmVm值降低?？梢源偈怪到档??？梢源偈姑复俜错懰俣燃涌斓奈镔|(zhì)酶促反響速度加快的物質(zhì) 。 酶的激活劑大多數(shù)是金屬離子，如酶的激活劑大多數(shù)是金屬離子，如K+K+、Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+等，唾液淀粉酶的激活劑為等，唾液淀粉酶的激活劑為Cl-Cl-。舉例1：草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶反響動(dòng)力學(xué)研討 酶反響動(dòng)力學(xué)利用酶反響動(dòng)力學(xué)利用Thermo MULTISKANSPECTRUMThermo MULTISKANSPECTRUM酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀, ,經(jīng)經(jīng)過(guò)延續(xù)分光光度分析法進(jìn)展分析。將過(guò)延續(xù)分光光度分析法進(jìn)展分析。將5

10、L GAT5L GAT酶液參與到酶液參與到295L295L的測(cè)活緩沖液的測(cè)活緩沖液(25mmol/L Hepes,pH (25mmol/L Hepes,pH 6.8,167mol/L AcCoA,10%6.8,167mol/L AcCoA,10%乙二醇乙二醇,0.12510.000 mmol/L,0.12510.000 mmol/L草甘膦草甘膦) )中中, ,以不加酶液的測(cè)活緩沖液作為對(duì)照。在以不加酶液的測(cè)活緩沖液作為對(duì)照。在235 nm235 nm處測(cè)定不同濃度梯度的草甘膦底物條件下的紫外分光光度處測(cè)定不同濃度梯度的草甘膦底物條件下的紫外分光光度值值, ,每隔每隔5 s5 s讀讀1 1次數(shù)次

11、數(shù), ,不斷到不斷到60 s60 s。經(jīng)過(guò)不同草甘膦底物的。經(jīng)過(guò)不同草甘膦底物的濃度濃度SS下下GATGAT催化轉(zhuǎn)乙酰反響的反響速率催化轉(zhuǎn)乙酰反響的反響速率v,v,以以1/S1/S為橫為橫坐標(biāo)坐標(biāo)1/v1/v為縱坐標(biāo)為縱坐標(biāo),Lin-eweaver-Burk,Lin-eweaver-Burk法雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖, ,求出求出米氏常數(shù)米氏常數(shù)KMKM和最大速率和最大速率vmax,vmax,而催化常數(shù)而催化常數(shù)kcat=vmax/E,Ekcat=vmax/E,E為酶濃度。詳細(xì)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)為酶濃度。詳細(xì)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)2-2-33。GATGAT酶的活性用催化效率酶的活性用催化效率kcat/K

12、Mkcat/KM表示。數(shù)據(jù)處置軟件表示。數(shù)據(jù)處置軟件為為GraphPad PrismGraphPad Prism。 舉例2:磁場(chǎng)和抑制劑對(duì)蓮藕多酚氧化酶反響動(dòng)力學(xué)的影響 經(jīng)過(guò)添加經(jīng)過(guò)添加VcVc和外加磁場(chǎng)處置和外加磁場(chǎng)處置, ,研討蓮藕多酚氧化酶研討蓮藕多酚氧化酶(PPO)(PPO)反反響動(dòng)力學(xué)的變化規(guī)律。以鄰苯二酚為底物響動(dòng)力學(xué)的變化規(guī)律。以鄰苯二酚為底物, ,蓮藕蓮藕PPOPPO褐變反褐變反響動(dòng)力學(xué)符合米氏方程所描畫的單底物酶促反響動(dòng)力學(xué)響動(dòng)力學(xué)符合米氏方程所描畫的單底物酶促反響動(dòng)力學(xué),Km,Km為為0775 mol/L,Vmax0775 mol/L,Vmax為為11150 U/min11150 U/min。VcVc對(duì)對(duì)PPOPPO有較有較強(qiáng)的抑制造用強(qiáng)的抑制造用, ,反響動(dòng)力學(xué)參數(shù)反響動(dòng)力學(xué)參數(shù)KmKm為為0081 mol/L,Vmax0081 mol/L,Vmax為為3243 U/min,3243 U/min,呈現(xiàn)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制呈現(xiàn)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制, ,表現(xiàn)為褐變出現(xiàn)滯后表現(xiàn)為褐變出現(xiàn)滯后, ,隨隨VcVc濃度的增大滯后時(shí)間逐漸增長(zhǎng)濃度的增大滯后時(shí)間逐漸增長(zhǎng), ,且呈現(xiàn)且呈現(xiàn)S S型趨勢(shì)型趨勢(shì),