酶反應動力學技術研究ppt課件

1、酶反響動力學 主要研討酶催化的反響速度以及影響反響速度的各種要素 在討論各種要素對酶促反響速度的影響時，通常測定其初始速度來代表酶促反響速度，即底物轉化量k+2k-1k+2時，時，Km=k-1/k+1=KsKm=k-1/k+1=Ks。 Km Km可用于判別反響級數：當可用于判別反響級數：當S0.01KmS100KmS100Km時，時，=Vmax=Vmax，反響為零級反響當，反響為零級反響當0.01KmS100Km0.01KmS100Km時，反響處于零級反響和一級時，反響處于零級反響和一級反響之間，為混合級反響反響之間，為混合級反響 關于Km和Vmax的意義有以下論述：KmKm是酶的特征性常數：

2、在一定條件下，某是酶的特征性常數：在一定條件下，某種酶的種酶的KmKm值是恒定的，因此可以經過測定值是恒定的，因此可以經過測定不同酶特別是一組同工酶的不同酶特別是一組同工酶的KmKm值，來值，來判別能否為不同的酶判別能否為不同的酶 。KmKm可用來判別酶的最適底物：當酶有幾種可用來判別酶的最適底物：當酶有幾種不同的底物存在時，不同的底物存在時，KmKm值最小者，為該酶值最小者，為該酶的最適底物的最適底物 關于Km和Vmax的意義有以下論述：KmKm可用來確定酶活性測定時所需的底物濃可用來確定酶活性測定時所需的底物濃度：當度：當S=10KmS=10Km時，時，=91%Vmax=91%Vmax，為

3、最適，為最適宜的測定酶活性所需的底物濃度。宜的測定酶活性所需的底物濃度。 VmaxVmax可用于酶的轉換數的計算：當酶的總可用于酶的轉換數的計算：當酶的總濃度和最大速度知時，可計算出酶的轉換濃度和最大速度知時，可計算出酶的轉換數，即單位時間內每個酶分子催化底物轉數，即單位時間內每個酶分子催化底物轉變?yōu)楫a物的分子數。變?yōu)楫a物的分子數。酶的濃度對于反響速度的影響 當反響系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時，酶當反響系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時，酶促反響速度與酶濃度成正比，即促反響速度與酶濃度成正比，即=kE=kE。其他要素對于酶促反響速度的影響 普通來說，酶促反響速度隨溫度的增高而普通來說，酶促反響速度隨溫度的增

4、高而加快，但當溫度添加到達某一點后，由于加快，但當溫度添加到達某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反響速度迅速下降酶蛋白的熱變性作用，反響速度迅速下降 察看察看pHpH對酶促反響速度的影響，通常為一對酶促反響速度的影響，通常為一鐘形曲線，即鐘形曲線，即pHpH過高或過低均可導致酶催過高或過低均可導致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的pHpH值就稱為酶的最適值就稱為酶的最適pH pH 酶的抑制劑 定義：凡是能降低酶促反響速度，但不引定義：凡是能降低酶促反響速度，但不引起酶分子變性失活的物質起酶分子變性失活的物質 分類：不可逆抑制造用和可逆抑制造用分類：不可

5、逆抑制造用和可逆抑制造用 。不可逆抑制造用 定義：抑制劑與酶分子的必需基團共價結定義：抑制劑與酶分子的必需基團共價結合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡一方法使酶活性恢復的抑制造用簡一方法使酶活性恢復的抑制造用 。 分類：酶的不可逆抑制造用包括專注性抑分類：酶的不可逆抑制造用包括專注性抑制如有機磷農藥對膽堿酯酶的抑制和制如有機磷農藥對膽堿酯酶的抑制和非專注性抑制如路易斯氣對巰基酶的抑非專注性抑制如路易斯氣對巰基酶的抑制兩種制兩種 ?？赡嬉种圃煊?定義：抑制劑以非共價鍵與酶分子可逆性定義：抑制劑以非共價鍵與酶分子可逆性結合呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等結合

6、呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等簡一方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復簡一方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復的抑制造用的抑制造用 。 分類：競爭性、反競爭性和非競爭性抑制分類：競爭性、反競爭性和非競爭性抑制幾種類型幾種類型 ?？赡嬉种圃煊?競爭性抑制：抑制劑與底物競爭與酶的同一活性競爭性抑制：抑制劑與底物競爭與酶的同一活性中心結合，從而干擾了酶與底物的結合，使酶的中心結合，從而干擾了酶與底物的結合，使酶的催化活性降低催化活性降低 特點：特點：a.a.競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產物；反響產物；b.b.抑制劑與酶的結合部位與底物與酶抑制劑與酶的結合部位與底

7、物與酶的結合部位一樣；的結合部位一樣；c.c.抑制劑濃度越大，那么抑制抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減??；造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減??；d.d.動力學參數：動力學參數：KmKm值增大，值增大，VmVm值不變。值不變。 可逆抑制造用 反競爭性抑制：抑制劑不能與游離酶結合反競爭性抑制：抑制劑不能與游離酶結合，但可與，但可與ESES復合物結合并阻止產物生成，復合物結合并阻止產物生成，使酶的催化活性降低使酶的催化活性降低 。 特點：特點：a.a.抑制劑與底物可同時與酶的不同抑制劑與底物可同時與酶的不同部位結合；部位結合；b.b.必需有底物存在，抑制劑才必需有底

8、物存在，抑制劑才干對酶產生抑制造用；干對酶產生抑制造用；c.c.動力學參數：動力學參數：KmKm減小，減小，VmVm降低。降低。 可逆抑制造用 非競爭性抑制：抑制劑既可以與游離酶結合，也非競爭性抑制：抑制劑既可以與游離酶結合，也可以與可以與ESES復合物結合，使酶的催化活性降低復合物結合，使酶的催化活性降低 。 特點特點:a.:a.底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結合；相結合；b.b.抑制劑對酶與底物的結合無影響，故抑制劑對酶與底物的結合無影響，故底物濃度的改動對抑制程度無影響；底物濃度的改動對抑制程度無影響；c.c.動力學參動力學參數：數：KmKm值

9、不變，值不變，VmVm值降低值降低 酶的激活劑 定義：定義：KmKm值不變，值不變，VmVm值降低?？梢源偈怪到档?。可以促使酶促反響速度加快的物質酶促反響速度加快的物質 。 酶的激活劑大多數是金屬離子，如酶的激活劑大多數是金屬離子，如K+K+、Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+等，唾液淀粉酶的激活劑為等，唾液淀粉酶的激活劑為Cl-Cl-。舉例1：草甘膦N-乙酰轉移酶反響動力學研討 酶反響動力學利用酶反響動力學利用Thermo MULTISKANSPECTRUMThermo MULTISKANSPECTRUM酶標儀酶標儀, ,經經過延續(xù)分光光度分析法進展分析。將過延續(xù)分光光度分析法進展分析。將5

10、L GAT5L GAT酶液參與到酶液參與到295L295L的測活緩沖液的測活緩沖液(25mmol/L Hepes,pH (25mmol/L Hepes,pH 6.8,167mol/L AcCoA,10%6.8,167mol/L AcCoA,10%乙二醇乙二醇,0.12510.000 mmol/L,0.12510.000 mmol/L草甘膦草甘膦) )中中, ,以不加酶液的測活緩沖液作為對照。在以不加酶液的測活緩沖液作為對照。在235 nm235 nm處測定不同濃度梯度的草甘膦底物條件下的紫外分光光度處測定不同濃度梯度的草甘膦底物條件下的紫外分光光度值值, ,每隔每隔5 s5 s讀讀1 1次數次

11、數, ,不斷到不斷到60 s60 s。經過不同草甘膦底物的。經過不同草甘膦底物的濃度濃度SS下下GATGAT催化轉乙酰反響的反響速率催化轉乙酰反響的反響速率v,v,以以1/S1/S為橫為橫坐標坐標1/v1/v為縱坐標為縱坐標,Lin-eweaver-Burk,Lin-eweaver-Burk法雙倒數作圖法雙倒數作圖, ,求出求出米氏常數米氏常數KMKM和最大速率和最大速率vmax,vmax,而催化常數而催化常數kcat=vmax/E,Ekcat=vmax/E,E為酶濃度。詳細測定方法參照文獻為酶濃度。詳細測定方法參照文獻2-2-33。GATGAT酶的活性用催化效率酶的活性用催化效率kcat/K

12、Mkcat/KM表示。數據處置軟件表示。數據處置軟件為為GraphPad PrismGraphPad Prism。 舉例2:磁場和抑制劑對蓮藕多酚氧化酶反響動力學的影響 經過添加經過添加VcVc和外加磁場處置和外加磁場處置, ,研討蓮藕多酚氧化酶研討蓮藕多酚氧化酶(PPO)(PPO)反反響動力學的變化規(guī)律。以鄰苯二酚為底物響動力學的變化規(guī)律。以鄰苯二酚為底物, ,蓮藕蓮藕PPOPPO褐變反褐變反響動力學符合米氏方程所描畫的單底物酶促反響動力學響動力學符合米氏方程所描畫的單底物酶促反響動力學,Km,Km為為0775 mol/L,Vmax0775 mol/L,Vmax為為11150 U/min11150 U/min。VcVc對對PPOPPO有較有較強的抑制造用強的抑制造用, ,反響動力學參數反響動力學參數KmKm為為0081 mol/L,Vmax0081 mol/L,Vmax為為3243 U/min,3243 U/min,呈現反競爭性抑制呈現反競爭性抑制, ,表現為褐變出現滯后表現為褐變出現滯后, ,隨隨VcVc濃度的增大滯后時間逐漸增長濃度的增大滯后時間逐漸增長, ,且呈現且呈現S S型趨勢型趨勢,