痤瘡丙酸桿菌促進小鼠外周血中樹突狀細胞（dc）的動員在體外對胃癌細胞的作用

1、痤瘡丙酸桿菌促進小鼠外周血中樹突狀細胞（dc）的動員在體外對胃癌細胞的作用（河北省滄州市屮西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院河北滄州061000）【摘要】目的：探討?zhàn)畀彵釛U菌促進小鼠外周血屮樹突狀細胞（dc）的動員在體外對胃癌細胞的作用。方法：c578bl7l6j（b6）小鼠注射痤瘡丙酸桿菌 后分離外周單核細胞，予以流式細胞儀將f4/80-b220-cd11c+細胞，體外加入 tnf-α> il-4、gm-csf等細胞因子培養(yǎng)，由混合淋巴細胞反應、表型分析、 形態(tài)學觀察鑒定其能否分化為成熟dc;將痤瘡丙酸桿菌動員的樹突狀細胞負載 h癌抗原后致敏細胞，觀察體外t細胞活化后對h癌細胞的殺傷效

2、應。結(jié)果：實 驗組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、7d后小鼠外周血屮 f4/80-b220-cdc+細胞變化顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），實 驗組第id后顯著升高，第3天達高峰后逐漸降低；h癌細胞與b16細胞相比， 痤瘡丙酸桿菌動貝的dc活化的t細胞及骨髓來源的dc活化的t細胞屮 ifn-γ干擾素的分泌水平差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。結(jié)論：痤瘡丙酸 桿菌可對f4/80-b220-cd11c+細胞迅速動仍進入小鼠外周血，細胞因子誘導后口j 分化為成熟的樹突狀細胞，體外誘導特異性t淋巴細胞系傷胃癌細胞，

3、同時合并 分泌大量inf-γ?！娟P鍵詞】實驗研究；胃癌；樹突狀細胞；痤瘡丙酸桿菌【中圖分類號】r735.2【文獻標識碼】b 【文章編號】1003-5028 （2015）7-0230-02胃癌在我國各種惡性腫瘤屮居首位，胃癌除進行化療及手術外，近年來 認為對胃癌患者進行腫瘤免疫治療臨床效果較佳，而其屮主要為痤瘡丙酸桿菌動 員外周血屮的樹突狀細胞，對腫瘤細胞產(chǎn)生系傷效應，效果確切1-2。探析痤瘡 丙酸桿菌促進小鼠外周血屮樹突狀細胞的動貝效應具有重要的臨床價值，故本研 究探究痤瘡丙酸桿菌（p.acnes）促進小鼠外周血屮樹突狀細胞（dc）的動員在體外對胃癌細胞的作用，效果滿意，現(xiàn)

4、報道如下。1資料和方法1.1實驗動物中科院實驗動物中心上海分中心提供8-10周齡的雌性 balb/c 小鼠及 c578bl/6j (b6)鼠。1.2主要實驗儀器及試劑美國bd公司提供的鼠tnf-α、il-4、 gm-csf、重組鼠干細胞因子(scf),中科院上海細胞所提供的黑色素瘤b16細 胞株及胃癌細胞株scg-7901,美國pharmigen公司生產(chǎn)的pe標記的抗la、 cd8αncd86 單抗、fitc 標i己的抗 cdllb、cd80、f4/80、cd40 單抗，fitc 標記的羊抗鼠igg二抗，鼠dec-205單抗，異硫氰酸熒光素標記的cdlc

5、單抗， 藻紅元熒光素(pe)標記的b220單抗，生物素標記的cy-chrome-conjugated streptavidin二抗及f4/80單抗;德國miltenyi公司生產(chǎn)的結(jié)合鼠cd3單抗的免 疫磁珠，美國endogen公司生產(chǎn)的鼠γ干擾素elisa檢測試劑盒。1.2實驗方法1)分離小鼠外周血f4/80-b220-cd11c+細胞:b6小鼠分 為八組，每組5只；實驗組將火活的痤瘡丙酸桿菌(lmg/100μipbs)由尾靜 脈注射，對照組予以pbs100μl注射，在注射前、注射lh、1、2、3、5、7d 后小鼠后心臟予以乙醚麻醉，穿刺采集0.

6、8ml外周血，肝素抗凝，外周血單個核 心板予以密度梯度離心法分離，細胞標記后由流式細胞儀進行f4/80-b220-cd11c+細胞分離，純度超過99%; 2)觀察及表型分析f4/80-b220-cd1c+細胞的形態(tài)學：選擇注射痤瘡丙酸桿菌24h后分選的 f4/80-b220-cd1c+細胞，在 24 孔培養(yǎng)板上接種，加入 10ng/mlll-4 及 4ng/mlgm-csf, 培養(yǎng)五天后更換新培養(yǎng)板，后用50ng/mltnf-α及4ng/mlgm-csf培養(yǎng)五天； 培養(yǎng)吋每隔2日予以培養(yǎng)基半量換液，用非特異性酯酶和giemsa染色后光鏡下 觀察；取分選的f4/80-b220

7、-cd1c+細胞，標記后予以流式細胞儀檢測共刺激分子 dec205、cd86、cd80 及 mhc-ii。3)混合淋巴細胞反應(mlr):采集 balb/c 小鼠脾臟細胞，應用密度梯度離心法分離mncs,將結(jié)合鼠cd3單抗的磁珠加入 后分選，注射痤瘡丙酸桿菌24h后的f4/80-b220-cd11c+細胞，將細胞因子及絲 裂霉素c (mmc)做相m處理后備用。將刺激細胞及反應t細胞加入96孔板，同吋設置單一細胞對照。培養(yǎng)五天后每孔加入mtt繼續(xù)培養(yǎng)4h離心后除去上清 液，加入異丙醇55nm酶標儀檢測0d值;4)t效應細胞的誘導、檢測ifn-γ： 凍融3次的腫瘤細胞懸液離心后

8、，上清液做可溶性抗原，痤瘡丙酸桿菌動員的 f4/80-b220-cd11c+及骨髓來源的dc經(jīng)細胞因子培養(yǎng)五日后，將腫瘤細胞抗原加 入每系dc，培養(yǎng)2日后收集懸浮細胞則為負載胃癌抗原的致敏dc;制備balb/c 小鼠脾臟t細胞，分別與痤瘡丙酸桿菌動員或骨髓來源的致敏dc培養(yǎng)五日，同 吋加入il-4及gm-csf，t細胞活化后為效應細胞，將b16細胞或胃癌細胞加入 96孔板每孔內(nèi)，根據(jù)1:1、5:1、10:1、25:1、50: 1、100:1的效：靶比加入t效 應細胞；培養(yǎng)20h后予以mtt法檢測。1.3統(tǒng)計學處理分析采用spss17.0軟件系統(tǒng)分析所有數(shù)據(jù)，計量資料 數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標準差表示

9、，組間比較采用t檢驗，p<0.05則具奮統(tǒng)計學 差異。2結(jié)果2.1痤瘡丙酸桿菌注射后小鼠外周血中f4/80-b220-cdc+細胞變化實驗 組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、7d后的小鼠外周血中 f4/80-b220-cdc+細胞變化顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),實 驗組第id后顯著升高，第3天達到高峰后逐漸降低，見表1。2.2痤瘡丙酸桿菌動員的f4/80-b220-cdc+細胞表型和形態(tài)學的分析注 射痤瘡丙酸桿菌24h后分選的f4/80-b220-cdc+細胞下顯示細胞多貼壁生長，少 數(shù)冇突起，較?。涣魇郊毎麅x檢測細胞共刺

10、激分子dec205、cd86、cd80、mhc-ii 低表達，cd40中表達，cdllb高表達，加入細胞因子后，懸浮細胞逐漸增多， 產(chǎn)生毛刺狀短突起，第0d顯示為大多數(shù)細胞懸浮，非特異性脂酶染色光鏡下觀 察，細胞表面突起顯著增多，形成典型樹突狀，共刺激分子dec205、cd80、cd86 及mhc-ii高表達，與骨髓來源的成熟dc表型一致，見表2。2.3特異性ctl反應中γ干擾素分泌情況胃癌細胞與b16細胞相比，痤瘡丙酸桿菌動員的dc活化的t細胞及骨髓來源的dc活化的t細胞中ifn-γ干擾素的分泌水平(1652.76±42.37)/

11、( 124.76±10.65)、 (1540.12±36.08)/( 40.12±6.08)差異有統(tǒng)計學意義(t =78.21, t =4.53,p<0.05)o3討論本研究探析痤瘡丙酸桿菌促進小鼠外周血中樹突狀細胞的動員對胃癌 的殺傷作用，結(jié)果顯示：實驗組注射痤瘡丙酸桿菌后lh、6h、id、2d、3d、5d、 7d后的小鼠外周血中f4/80-b220-cdc+細胞變化顯著高于對照組，差異奮統(tǒng)計學 意義(p<0.05),實驗組第id后顯著升高，第3天達到高峰后逐漸降低；注射 痤瘡丙酸桿菌24h后分選的

12、f4/80-b220-cdc+細胞下顯示細胞多貼壁生長，少數(shù) 有突起，較小3-4;流式細胞儀檢測細胞共刺激分子dec205、cd86、cd80、mhc-ii 低表達，cd40中表達，cdllb高表達，加入細胞因子后，懸浮細胞逐漸增多， 產(chǎn)生毛刺狀短突起，第10d顯示為大多數(shù)細胞懸浮，非特異性脂酶染色光鏡下觀 察，細胞表面突起顯著增多，形成典型樹突狀，共刺激分子dec205、cd80、cd86 及mhc-ii高表達，與骨髓來源的成熟dc表型一致；胃癌細胞與b16細胞相比， 痤瘡丙酸桿菌動員的dc活化的t細胞及骨髓來源的dc活化的t細胞中 ifn-γ干擾素的分泌水平差異有統(tǒng)計學

13、意義(p<0.05)，與牛超，徐建婷 等5】的研究結(jié)果人體一致，注射痤瘡丙酸桿菌后，外周血中f4/80-b220-cdc+細 胞顯著升高，與單核細胞十分相似，而體外mlr中刺激異源性t細胞增殖能力 較弱，經(jīng)由細胞因子誘導后，外形上出現(xiàn)典型的樹枝狀突起，而dec205、cd86、 cd80、cdllc、mhc ii類分子高表達，體外出現(xiàn)較強的t細胞增殖能力，dc缺 少特異性表面標志，經(jīng)由功能、表型、形態(tài)等方面綜合分析確定。綜上所述，痤 瘡丙酸桿菌可對f4/80-b220-cd11c+細胞迅速動員進入小鼠外周血，細胞因子誘 導后可分化為成熟的樹突狀細胞，體外誘導特異性t淋巴細胞殺傷胃癌細胞，同 吋合并分泌大量inf-γ。參考文獻：1】陳彥，汪良，張雁云.痤瘡丙酸桿菌促樹突狀細胞前體細胞動員及其對胃癌的治療效應.江蘇醫(yī)藥,2012,32(9):144-145.2】肖偉明，吳克艷，龔衛(wèi)娟，等.胃癌組織中cdla樹突狀細胞密度和血管內(nèi)皮生長因 子表達及其相關性.中國腫瘤臨床,2012,31(21):179-182.3】張錦英，束永前,黃普文，等.抗原負載樹突狀細胞刺激細胞因