第一代測序技術(shù)

1、編輯ppt1測序技術(shù)測序技術(shù)卡麗比努爾艾依提應(yīng)用微生物編輯ppt2目錄第一代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)（Illumina測序儀，SOLiD測序儀，454基因組測，Ion Torrent 測序）第三代測序技術(shù)高通量測序技術(shù)編輯ppt3第一代測序技術(shù)的發(fā)明人利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止測定DNA核苷酸序列的方法。是英國劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家Fred Sanger及其同事在1997年發(fā)明的。編輯ppt4第一代測序技術(shù) 傳統(tǒng)的鏈終止法，化學(xué)講解法，以及在它們的基礎(chǔ)上來的各種DNA測序技術(shù)傳統(tǒng)成為第一代DNA測序技術(shù)。編輯ppt5編輯ppt6原理第一步是短寡聚核苷酸在每個(gè)分子的相同位置上退火，然

2、后該寡聚核苷酸就充當(dāng)引物來合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3OH基團(tuán)，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組（如下圖）進(jìn)行，每一組分別用四種ddNTP（雙脫氧核苷酸）中的一種來進(jìn)行終止，再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。編輯ppt7這有四組試劑，第一組含有A,T,C三種脫氧核苷酸，G這一種雙脫氧核苷酸編輯ppt8測序是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在

3、某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。 Sanger法測序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。編輯ppt9 每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)

4、，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。編輯ppt10編輯ppt11應(yīng)用編輯ppt12 具有代表性的新一代DNA測序儀大規(guī)模平行測序平臺(tái)（massively parallel DNA sequencing platform）的出現(xiàn)不僅令DNA測序費(fèi)用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項(xiàng)以前專屬于大型測序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術(shù)有助于人們以更低廉的價(jià)格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)最近市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品，例如美國Ro

5、che Applied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美國Applied Biosystems公司的SOLiD測序儀、Dover/Harvard公司的Polonator測序儀以及美國Helicos公司的HeliScope單分子測序儀。所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略循環(huán)芯片測序法（cyclic-array sequencing），也可將其稱為“新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)”。編輯ppt13循環(huán)芯片測序法所謂的循環(huán)芯片測序法，簡言之就是對(duì)布滿DNA樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于D

6、NA的聚合酶反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交及延伸）以及熒光序列讀取反應(yīng)。與傳統(tǒng)測序法相比，循環(huán)芯片測序法具有操作更簡易、費(fèi)用更低廉的優(yōu)勢，于是很快就獲得了廣泛的應(yīng)用。編輯ppt14編輯ppt15雖然這些新一代測序儀以及芯片的實(shí)際制作過程似乎都和傳統(tǒng)的測序方法有很大的不同，而且各有特點(diǎn)，但實(shí)際上它們背后的原理和技術(shù)都是非常相似甚至是相同的（圖1b）。新一代測序法首先也是將基因組DNA隨機(jī)切割成小片段DNA分子，然后在體外給這些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫，也可以使用配對(duì)標(biāo)簽（mate-paired tag）制成跨步文庫（jumping libraries）。隨后可以通過原位polony（in

7、 situ polony，小詞典1）、微乳液PCR（emulsion PCR）或橋式PCR（bridge PCR）（圖5）等方法獲得測序模板。編輯ppt16上述方法有一個(gè)共同點(diǎn)，那就是任何一個(gè)小片段DNA分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都是在空間上聚集的：原位polony法和橋式PCR法中所有的產(chǎn)物都集中在平板的某處，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的產(chǎn)物都集中在微珠的表面。真正的測序反應(yīng)本身和傳統(tǒng)測序法一樣，是由重復(fù)的聚合酶促反應(yīng)和最后的熒光讀取分析反應(yīng)組成（圖6）。本文討論的所有測序儀都是使用合成測序法（sequencing by synthesis），即通過聚合酶或連接酶不斷地延伸

8、引物獲得模板序列，最后對(duì)每一輪反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行熒光圖像采集、分析，獲得序列結(jié)果。編輯ppt17以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程（1）文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條

9、成簇分布的雙鏈待測片段。（3）測序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一個(gè)循環(huán)開始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析.編輯ppt18 Ion Torrent測序 Ion Torrent個(gè)人化操作基因組測序儀（PGMTM）是第一臺(tái)基于半導(dǎo)體技術(shù)的測序儀。與其他測序技術(shù)相比，使用該項(xiàng)技術(shù)的測序系統(tǒng)更簡單、更快速、及更易升級(jí)。該測序儀與其他高通量測序儀特征互補(bǔ)，可以迅速完成應(yīng)急服務(wù)項(xiàng)目，縮短服務(wù)周期，增加服務(wù)效率。主要應(yīng)用領(lǐng)域：擴(kuò)增子測序，RNA單鏈測序，基因組及宏基因組測序測序編輯ppt19 Ion Torrent 測序原理 鳥槍法建庫基于油包水PCR的微珠模板擴(kuò)

10、增微珠加上測序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微傳感器的測序芯片在測序芯片表面，分次分別流過種dNTP，微珠表面的核酸進(jìn)行邊合成邊測序的反應(yīng)。每次發(fā)生聚合反應(yīng)，釋放出H+離子，微珠周圍微環(huán)境中的PH值發(fā)生改變。微電極檢測PH值的改變，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的堿基信號(hào)，最后得到DNA序列編輯ppt20Roche 454 的測序原理鳥槍法建庫基于油包水PCR的微珠模板擴(kuò)增微珠加上測序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微傳感器的測序芯片在測序芯片表面，分次分別流過種dNTP，微珠表面的核酸進(jìn)行邊合成邊測序的反應(yīng)。每次發(fā)生聚合反應(yīng)，釋放出焦磷酸焦磷酸被焦磷酸酶水解，釋放出光子光通過光纖被傳遞到光探頭光信號(hào)被轉(zhuǎn)換成堿基信

11、息，得到DNA序列。編輯ppt21SOLiD測序SOLiD使用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時(shí)校正測序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)。 編輯ppt22SoLID測序原理鳥槍法建庫油包水PCR，得到長了DNA片段的珠子珠子放到測序芯片上加入4種熒光色的寡聚物探針進(jìn)行雜交，探針上有2個(gè)位置的堿基是特定的，別的位置是簡并的堿基加入連接本酶，把能夠雜上的寡聚物連到測序引物上洗掉過量的探針編輯ppt23激光掃描看熒光重復(fù)47步驟

12、，得到延長3650個(gè)堿基的長度洗掉第一次的測序延長鏈錯(cuò)位加入熒光探針，重復(fù)48的過程把錯(cuò)位的熒光信號(hào)排列組合，得到DNA序列編輯ppt24應(yīng)用編輯ppt25編輯ppt26高通量測序高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（Next-generation sequencing technology），以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)

13、、聚合酶克?。≒olony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。編輯ppt27高通量測序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)足見其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測序使得對(duì)一個(gè)

14、物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。編輯ppt28實(shí)驗(yàn)過程1.樣本準(zhǔn)備（sample fragmentation）2.文庫構(gòu)建(library preparation)3.測序反應(yīng)(sequencing reaction)4.數(shù)據(jù)分析(data analysis)編輯ppt29技術(shù)應(yīng)用測序技術(shù)推進(jìn)科學(xué)研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。這邊需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用-目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。目

15、前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。以上我們盤點(diǎn)了2010年第二代測序技術(shù)的最新進(jìn)展和相關(guān)應(yīng)用。但是除了第二代測序之外，還有另外一種以單分子實(shí)時(shí)測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)也正在如火如荼的發(fā)展中，只是還沒有正式發(fā)布。所以目前科學(xué)界所說的高通量測序還指的是第二代測序。編輯ppt30意義高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降, 以人類基因組測序?yàn)槔? 上世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計(jì)劃花費(fèi) 30 億美元解碼了人類生命密碼, 而第二代測序使得人類基因組測序已進(jìn)入萬(美)元基因組時(shí)代。如此低廉的單堿

16、基測序成本使得我們可以實(shí)施更多物種的基因組計(jì)劃從而解密更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時(shí)在已完成基因組序列測定的物種中, 對(duì)該物種的其他品種進(jìn)行大規(guī)模地全基因組重測序也成為了可能。編輯ppt31編輯ppt32第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)。DNA測序時(shí)，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測序。編輯ppt33原理第三代測序技術(shù)原理主要分為兩大技術(shù)陣營：第一大陣營是單分子熒光測序，代表性的技術(shù)為美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術(shù)和美國太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMART技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。

17、當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二大陣營為納米孔測序，代表性的公司為英國牛津納米孔公司。新型納米孔測序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔 來實(shí)現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號(hào)的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測序。編輯

18、ppt34第三代測序技術(shù)解決關(guān)鍵技術(shù)第一：因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定

19、顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。 第二：共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對(duì)集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。編輯ppt35第三代測序技術(shù)特點(diǎn) 它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍. 它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。 它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。 直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。 第二個(gè)是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。編輯ppt36編輯ppt37第三代測序技術(shù)的應(yīng)用基因組測序：由于具有讀長長的特點(diǎn)，SMRT測序平臺(tái)在基因組測序中能降低測序后的Contig數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和