細(xì)菌分離培養(yǎng)

1、；試驗(yàn)一 細(xì)菌分離培養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)康模?、掌握培養(yǎng)基的原理、分類及配置方法。 2、熟悉無(wú)菌操作技術(shù)、細(xì)菌標(biāo)本的分離、純化接種方法 3、熟悉細(xì)菌培養(yǎng)所用的基本儀器及使用方法。試驗(yàn)儀器：生物安全柜、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電冰箱、低溫冰箱、蒸汽高壓消毒器、超凈工作臺(tái)、電子天平、普通光學(xué)顯微鏡、鼓風(fēng)干燥箱，電磁爐，微波爐等試驗(yàn)材料：1、 菌種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌（陰性、陽(yáng)性各一）。2、 培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基（斜面、平板）。試驗(yàn)步驟：1、緒論錄象（約30分鐘）2、宣讀微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)則3、細(xì)菌接種：平板傾注，每人傾注一個(gè)平板； 平板劃線，四區(qū)劃線，分離單個(gè)菌落。細(xì)菌斜面接種。4、結(jié)果報(bào)告5、討論講述：一、細(xì)

2、菌的人工培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氣體環(huán)境、pH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和所需要的條件也不盡相同。 （一）影響微生物生長(zhǎng)的因素微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長(zhǎng)的因素很多，簡(jiǎn)要介紹如下。1) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)細(xì)菌所需要的營(yíng)養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長(zhǎng)，可謂是無(wú)孔不入。然而營(yíng)養(yǎng)太低時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)就會(huì)遇到困難，甚至還會(huì)死亡。故有的營(yíng)養(yǎng)要求相對(duì)較高的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)需加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持其生長(zhǎng)需要。）溫度在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)：最低生長(zhǎng)

3、溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度。在生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率不一樣。微生物只有處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度才最快，待時(shí)最短。超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度，微生物不會(huì)生長(zhǎng)，溫度太低，甚至?xí)劳觥３^(guò)最高生長(zhǎng)溫度，微生物也要停止生長(zhǎng)，溫度過(guò)高。也會(huì)死亡。一般情況下，每種微生物的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根據(jù)微生物最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類型：a.嗜冷微生物：其是適生長(zhǎng)溫度多數(shù)在- 1020之間b.中溫微生物：其最適生長(zhǎng)溫度一般在2045之間c.嗜熱微生物：生長(zhǎng)溫度在45以上。）濕度水分是微生物進(jìn)行生長(zhǎng)的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。

4、微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長(zhǎng)，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長(zhǎng)發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。）氣體A 氧氣按照微生物對(duì)氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個(gè)類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒(méi)有氧氣，便不能生長(zhǎng)，但是高濃度的氧氣對(duì)需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長(zhǎng)。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類型。b.兼性需氧微生物這類微生物在有氧氣存在或無(wú)氧氣存在情況下，都能生長(zhǎng)，只不過(guò)所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。在無(wú)氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無(wú)氧乙醇發(fā)酵。 c.微量需氧微生

5、物這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長(zhǎng)最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物這類微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會(huì)被氧氣所殺死。c.厭氧微生物這類微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不需要分子氧。分子氧存在對(duì)它們生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。B其他氣體： 有的細(xì)菌生長(zhǎng)需要氮?dú)?、二氧化碳等氣體物理因素：如射線-日光、紫外線、聲波；5）其他因素： 化學(xué)因素：Ph、消毒劑、防腐劑等 生物因素：抗生素、細(xì)菌素、噬菌體等（二）培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)成分：水、氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子1、培養(yǎng)基的主要成分 凝固物質(zhì)：瓊脂、明膠、卵蛋白及血清等 抑

6、制劑：加入某些化學(xué)物質(zhì)（如抗生素等藥物）， 抑制某些非目的菌生長(zhǎng)，有利于目的菌的生長(zhǎng) 按用途作用：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的分類 按固型成分：固體培養(yǎng)基（2-3%） 平板、斜面 半固體培養(yǎng)基（0.25-0.3%） 液體培養(yǎng)基 按工藝： 天然培養(yǎng)基、人工培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基的制作過(guò)程：配料-溶解-調(diào)pH-過(guò)濾-分裝-高壓滅菌-（必要時(shí)要做檢菌試驗(yàn)）備用（三）、培養(yǎng)方法根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。1、需氧培養(yǎng)：也稱“ 好氣培養(yǎng)”。就是說(shuō)這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(zhǎng)良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲

7、得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。2、二氧化碳培養(yǎng)：某些細(xì)菌（如布魯菌、腦膜炎奈瑟菌等）須在一定濃度的二氧化碳環(huán)境中才能生長(zhǎng)；常用燭缸法、化學(xué)法、二氧化碳培養(yǎng)箱3、厭氧培養(yǎng)：也稱“ 厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。常用：皰肉法、焦性沒(méi)食子酸法、硫乙醇酸鈉法、氣袋法、厭氧罐法、厭氧箱培養(yǎng)法4、微需氧培養(yǎng)法：有些微需氧菌（如幽門螺旋菌等）在低氧壓的條件下生長(zhǎng)良好，可用抽氣換氣法充5%氧氣、10%二氧化碳、85%氮?dú)庥谂囵B(yǎng)罐中，37度培養(yǎng)。（四）接種方法選擇含有一種以上的微

8、生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化。平板的用途：供分離劃線；分離劃線的目的是為了得到單個(gè)菌落，以備進(jìn)一步鑒定；擴(kuò)大培養(yǎng)，得到更多的菌苔。斜面的用途：斜面培養(yǎng)一般用于保存菌種。純培養(yǎng)以得到更多菌苔，用于鑒定 。無(wú)菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作

9、。二、示教：1、接種環(huán)的制作及使用：接種環(huán)的拿法及注意事項(xiàng)；接種和分離工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀2、平板的傾注方法；瓊脂量約占平板深度的1/3-1/2為宜。3、細(xì)菌平板四區(qū)或三區(qū)劃線方法：平板的拿法，劃線時(shí)手法要輕、密，但不能重疊。平板培養(yǎng)基接種的分離培養(yǎng)法4、 斜面接種方法:蛇形劃線。注意事項(xiàng)：1、傾注平板時(shí)，皿蓋要半開(kāi)，留有通氣孔，待瓊脂凝固后立即蓋上皿蓋，翻轉(zhuǎn)放置，以防蒸餾水流淌到培養(yǎng)基上，影響培養(yǎng)結(jié)果。（平板表面有水，影響分離；蒸餾水由抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用）2、先做標(biāo)記后操作，試管標(biāo)記在管壁上，平板標(biāo)記在皿底上。3、平板劃線時(shí)要盡可能輕且密，切忌用力過(guò)重劃破瓊脂和重復(fù)劃線，失去分離意義。4、斜面蛇形劃線，可反復(fù)重復(fù)劃。5、培養(yǎng)時(shí)，試管要站立培養(yǎng)，以防長(zhǎng)生蒸餾水影響結(jié)