大豆磷脂微生物限度檢查法驗證

1、 驗證文件大豆磷脂微生物限度檢測方法驗證起 草 人 起草日期 審 核 人 審核日期 批 準(zhǔn) 人 批準(zhǔn)日期 文件編號 目 錄1適用范圍- 1 -2目的- 1 -3概述- 1 -4驗證所需要的儀器設(shè)備及文件- 1 -5可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)- 2 -6測試方法- 5 -7異常情況處理- 15 -8測試結(jié)果- 16 -9結(jié)論- 16 -10再驗證周期- 16 -11附表- 16 -1適用范圍本驗證方案適用于大豆磷脂微生物限度檢查法的驗證。2目的建立該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，并對其有效性進(jìn)行評價，確保試驗方法的完整性，保證檢驗結(jié)果的可靠性。3概述3.1按中國藥典2010年版附錄 J微生物限度檢查法方法

2、的“供試品的制備”項下制備方法2（固體、半固體或黏稠液供試品，取供試品10g，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻,作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻）制備。 按“細(xì)菌，霉菌，酵母菌計數(shù)”項下檢查法1平皿法進(jìn)行細(xì)菌，霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證。按控制菌的檢查法進(jìn)行控制菌檢查法驗證。驗證試驗使用一批產(chǎn)品進(jìn)行三次獨立平行試驗。3.2驗證時間： 年 月 日 到 年 月 日3.3驗證產(chǎn)品批號： 4驗證所需要的儀器設(shè)備及文件4.1驗證需用儀器設(shè)備器具名稱規(guī)格型號檢定日期檢定單位有效期霉菌培養(yǎng)箱SHH-150JS 年

3、月 日 年生化培養(yǎng)箱SHH-150L 年 月 日 年手提式壓力蒸汽滅菌器XFS-280A 年 月 日 年4.2驗證所需要的文件及存放地方資料名稱存放地點SHH-150JS霉菌培養(yǎng)箱操作維護(hù)保養(yǎng)SOPSHH-150L 生化培養(yǎng)箱操作維護(hù)保養(yǎng)SOPXFS-280A 手提式壓力蒸汽滅菌器操作維護(hù)保養(yǎng)SOP微生物限度檢查法SOP5可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)5.1大豆磷脂微生物限度檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項目標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定細(xì)菌總數(shù)100個/g霉菌、酵母菌100個/g大腸埃希菌不得檢出沙門菌不得檢出銅綠假單胞菌不得檢出金黃色葡萄球菌不得檢出5.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率

4、應(yīng)不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗中實驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。5.3控制菌檢查方法驗證結(jié)果判斷若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行驗證。5.4大腸埃希菌檢查結(jié)果判斷如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃

5、線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判定供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。培養(yǎng)基大腸埃希菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤當(dāng)陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗M U G 呈陽性，供試品M U G 陽性、靛基質(zhì)陽

6、性，報告lg或l m l供試品檢出大腸埃希菌。M U G 陰性、靛基質(zhì)陰性，報告lg或l m l供試品未檢出大腸埃希菌。M U G 陽性、靛基質(zhì)陰性、I M V i C試驗為一+ 、革蘭陰性桿菌，報告lg或l m l供試品檢出大腸埃希菌;M U G 陰性、靛基質(zhì)陽性、I M V i C試驗為+ + 、革蘭陰性桿菌，報告l g或l m l供試品檢出大腸埃希菌。供試品培養(yǎng)物檢查不符合二項中的任一項，報告l g或l m l供試品未檢出大腸埃希菌。當(dāng)陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸埃希菌，不能做出檢驗報告。5.5沙門菌檢查結(jié)果判斷供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符

7、合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗陽性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)10030min處理后凝集試驗為陽性反應(yīng)），報告10g或10ml供試品檢出沙門菌。供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)及沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗為陰性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)10030min處理后凝集試驗為陰性反應(yīng)），報告lg或lml供試品未檢出沙門菌。 供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種送交有關(guān)單位進(jìn)一步鑒定后，再作報告。 供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗陰性反應(yīng)。供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0 多價1 血清凝集反應(yīng)呈陽性反應(yīng)。 對

8、已檢出沙門菌的供試品分離菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性,推斷可能菌型，增加生化試驗項目及沙門菌單因子血清“0”及“H”凝集試驗進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)基沙門菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂（DHL)無色至淺橙色,半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S )無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB)無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC)無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗5.6銅綠假單胞菌檢查結(jié)果判斷供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告lg或lml供試品檢出銅

9、綠假單胞菌。 供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，亦報告lg或lml供試品檢出銅綠假單胞菌。凡與以上兩種結(jié)果不符時，報告lg或lml供試品未檢出銅綠假單胞菌。5.7金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果判斷如果革蘭染色鏡檢結(jié)果清晰可靠(必要時加做已知革蘭染色鏡檢結(jié)果的細(xì)菌進(jìn)行染色質(zhì)量控制），凝固酶試驗陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗呈陽性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報告或處理：疑似菌革蘭染色鏡檢呈陽性球菌,血漿凝固酶試驗陽性反應(yīng)者，報告lg或lml供試品檢出金黃色葡萄球菌(少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄

10、球菌屬的其他菌種）。 革蘭染色鏡檢鏡檢不是革蘭陽性球菌,或血漿凝固酶試驗陰性反應(yīng)，報告lg或lml供試品禾檢出金黃色葡萄球菌。陰性對照有菌生長，試驗結(jié)果無效。陽性對照試驗呈陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)加做驗證試驗，考察檢品是否有抑菌活性。培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌落形態(tài)卵黃氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑12mm甘露醇氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm6測試方法6.1供試品大豆磷脂，批號 。6.2培養(yǎng)基及菌種6.2.1采用符合中國藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，中國藥品生物制品檢定所制。6.2.2 枯草芽孢桿菌CMCC(

11、B)63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、 黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094、銅綠假單胞菌CMCC(B)101046.3菌液制備6.3.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查的菌液制備6.3.1.1取新鮮的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)3035培養(yǎng)1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.1.2取新鮮的白色念珠菌的培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)232

12、8培養(yǎng)2448h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.1.3取新鮮的黑曲霉培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)2328培養(yǎng)57d，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。6.3.2控制菌檢查的菌液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)物少許，接種至1

13、0 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置3035培養(yǎng)1824h，取均勻培養(yǎng)物lml,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每lml含菌10lOOcfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對照試驗的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。6.3.3供試品制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。6.4驗證試驗方法細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢驗方法驗證采用上述供試品，進(jìn)行3次平行試驗，分別人工污染上述5種代表試驗菌株?？刂凭鷻z驗方法驗證采用上述批供試品進(jìn)行實驗。6.4.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證試驗6.4.1.1試驗分組6.4.1.1.1供試品對照組：取上述供試液1ml，按菌

14、落計數(shù)方法測定供試品本底細(xì)菌數(shù)；取上述供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)；6.4.1.1.2菌液組：分別取上述5種試驗菌懸液1ml，按菌落計數(shù)方法測定所加試驗菌數(shù)。6.4.1.1.3試驗組：取1：10供試液1ml注入無菌平皿，分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗菌懸液各1ml，按平皿法測定其菌數(shù)。取1：10供試液1ml注入無菌平皿，分別加入白色念珠菌和黑曲霉懸液各1ml，按平皿法測定霉菌數(shù)。6.4.1.1.4稀釋劑對照組：取實驗用的稀釋液1ml代替供試品，加入實驗菌，按菌落計數(shù)方法測定所加的試驗菌數(shù)。6.4.1.2驗證試驗操作6.4.1.2.1取供試品10

15、g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。取上述供試液1ml，注入無菌平皿中，注入1520ml不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。6.4.1.2.2陰性對照試驗取實驗用的稀釋液1ml，注入無菌平皿中，注入1520ml不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，均不得有菌生長。6.4.1.2.3培養(yǎng)和計數(shù) 細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至57天進(jìn)行菌落計數(shù)報告。菌落蔓

16、延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌，細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為計數(shù)結(jié)果。6.4.1.3菌數(shù)報告

17、規(guī)則以相當(dāng)于1g供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若無菌落生長，以<1報告菌數(shù)，或<1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌落數(shù)。6.4.1.4計算公式試 驗組的菌回 收率 % 6.4.2控制菌的檢查驗證試驗6.4.2.1大腸埃希菌試驗組：取1：10供試液10ml和大腸埃希菌懸液1ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陽性對照試驗：取大腸埃希菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出大腸埃希菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。大腸埃希菌的試驗：按上述分組接種至1

18、00ml膽鹽乳酸培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48h。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作為本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。如呈現(xiàn)M U G 陽性、綻基質(zhì)陰性或M U G 陰性、靛基質(zhì)陽性時，應(yīng)將上述供試品B L 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取12 環(huán)培養(yǎng)液劃線于E M B 或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)182

19、4h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表1 所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。當(dāng)陽性對照的平板呈典型菌落生長時，若E M B 或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和I M V i C試驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。如E M B 或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1 所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23 個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面,培養(yǎng)1824h,作以下檢査。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)

20、液劃線接種于E M B 瓊脂平板，培養(yǎng)1824h，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng),作以下檢查。革蘭染色鏡檢、鏡檢以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過火焰23 次干燥使固定。滴加結(jié)晶紫染液，染色lmin,水洗。滴加碘液,媒染lmin,水洗，以濾紙吸干余水。滴加9 5 % 乙醇,脫色2030s,至流出液無色,水洗。滴加沙黃染液，復(fù)染lmin，待干后，鏡檢。染色結(jié)果革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色;革蘭陰性菌呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。生化試驗 乳糖發(fā)酵試驗取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)2448h，觀察

21、產(chǎn)酸(指示劑為酸性品紅者為紅色;指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣(小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小都是產(chǎn)氣）。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5 % 乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于2 4 h出現(xiàn)陽性?；蜻m當(dāng)延長培養(yǎng)時間。靛基質(zhì)試驗(I)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)244 8h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98% 的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗為陽性。一般2 4 h即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1 或2 m l培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如錠基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)2 4h，作靛基質(zhì)試驗。甲基紅試驗( M

22、 ) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48士2 h，于培養(yǎng)液中加人甲基紅指示液2 3 滴（約每m l 培養(yǎng)液加指示液1 滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。乙釀甲基甲醇生成試驗( V - P )取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2 m l培養(yǎng)液中加入cr萘酚乙醇試液lml,混勻，再加4 0 %氫氧化鉀試液0.4ml,充分振搖，在4h(通常在30min)內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗（C ) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2 4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)

23、基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時為陽性,培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為陰性。6.4.2.2沙門菌試驗組：取1：10供試液10ml和沙門菌懸液1ml，接種至200ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至200ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。陽性對照試驗：取沙門菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出沙門菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。沙門菌的試驗：按上述分組，3035培養(yǎng)1824 h后觀察。搖動陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無菌生長。輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照瓶，分別吸取lml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培

24、養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)1824h。輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照瓶，分別以接種環(huán)沾取12 環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂(SS)平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個，倒置培養(yǎng)2448h，必要時延長至4048h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。初步鑒別試驗從每個供試品的分離平板上挑取23 個疑似菌落(菌落形態(tài)特征與表3 所列的形態(tài)特征相符或疑似)分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時應(yīng)以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面(或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面)并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的

25、反應(yīng)為：斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S)并顯示黃色(產(chǎn)酸）；斜面紅色，底層黃色;斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色，斜面未見紅色底層未見黃色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗，血清凝集試驗及革蘭染色鏡檢,鏡檢。沙門菌應(yīng)為革蘭陰性桿菌。生化試驗靛基質(zhì)試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢査法靛基質(zhì)試驗項下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。脲酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于

26、脲瓊脂斜面，培養(yǎng)2 4 h ,觀察結(jié)果。斜面變?yōu)榧t色為陽性反應(yīng),沙門菌屬為陰性反應(yīng)。氰化鉀試驗將培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2024h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1 環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。對照管內(nèi)有菌生長（混濁），而試驗管也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長（混濁）而試驗管無菌生長（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時須謹(jǐn)慎

27、，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌。賴氨酸脫羧酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基中，同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照管，培養(yǎng)244 8 h觀察結(jié)果。對照管黃色(產(chǎn)酸），試驗管呈紫色為陽性反應(yīng)(賴氨酸脫羧產(chǎn)堿）；試驗管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陽性反應(yīng)。動力試驗用接種針沾取培養(yǎng)物,穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。有動力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象;無動力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀;無動力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2 3 天后，再行

28、觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外，均具有周身鞭毛，能運動，動力試驗陽性。沙門菌生化反應(yīng)的初步鑒別見下表。針對三糖鐵瓊脂上的反應(yīng)，+ 產(chǎn)酸(黃色），陽性，陽性率,> 9 0 % ; 產(chǎn)堿(紅色），陰性，陰性率，> 9 0 % ; + / 多數(shù)陽性、少數(shù)陰性；+ S 產(chǎn)生少量氣體; + 陽性，陽性率,> 9 0 % 廣陰性，陰性率，> 9 0 % ; + / - 多數(shù)陽性、少數(shù)陰性，一/ + 多數(shù)陰性、少數(shù)陽性（本表依據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗，參考第八版美國臨床微生物手冊）；反應(yīng)序號1 除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗、賴氨酸脫羧酶試驗三項中有一項異常；反應(yīng)序號2僅靛

29、基質(zhì)陽性;可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗，或加做部分生化試驗,判定是否為沙門菌,其他情況可排除沙門菌。血清學(xué)凝集試驗準(zhǔn)備1 片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門菌屬0 多價1 血清23 環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作，作為陰性對照。用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過濃。將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，試驗組任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)通常在3min 內(nèi)發(fā)生。有時因血清效價低、反應(yīng)遲

30、緩時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果。如果仍然沒有出現(xiàn)凝集，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌懸液，在100°C水浴中保溫30min，以除去可能存在的V i抗原，待冷，再做凝集試驗，如出現(xiàn)凝集,仍判為陽性反應(yīng);如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)。如對照試驗出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行處理后再作凝集試驗。6.4.2.3銅綠假單胞菌試驗組：取1：10供試液10ml和銅綠假單胞菌懸液1ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陽性對照試驗：取銅綠

31、假單胞菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出銅綠假單胞菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。銅綠假單胞菌的試驗：按上述分組，于3035培養(yǎng)1824h(必要時可延至48h)。陰性對照菌應(yīng)無菌生長。輕輕搖動上述增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)取12環(huán)培養(yǎng)液（如有菌膜應(yīng)挑取之），劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于3035培養(yǎng)1824h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象,在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性藍(lán)綠色素擴(kuò)散，使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色，但亦有不產(chǎn)色

32、素的菌株。菌落還有粗糙型和黏液型等，應(yīng)注意挑選。純培養(yǎng)供試品分離平板生長典型菌落或呈疑似菌落時，以接種計輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取23 個疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面,培養(yǎng)，作以下檢查。革蘭染色鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列。生化試驗可用銅綠假單胞菌C M C C (B) 10104做生化試驗的陽性對照株。氧化酶試驗取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無菌玻璃棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1 滴新配制的1 % 二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30S 內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應(yīng)。若培養(yǎng)物

33、不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)注意：( 1 )試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)結(jié)果不可靠。( 2 )試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種計（環(huán)）（白金材料除外）挑取菌（苔），否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。( 3 )試劑宜新鮮配制，放置過久,二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。( 4 )反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過多，以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。( 5 )麥康凱、S S培養(yǎng)基等含糖培養(yǎng)基上的菌落不適于做氧化酶試驗，因為糖分解產(chǎn)酸抑制氧化酶活性。綠膿菌素試驗取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（P D P )斜面上，3035°C

34、培、養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素,在試管內(nèi)加三氯甲烷3 5 m l，以無菌玻棒攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在三氯甲烷內(nèi)。靜置片刻，待三氯甲烷分層，用吸管將三氯甲烷移至另一試管中，加入鹽酸試液（lmol/L)約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色、即為陽性反應(yīng)，無粉紅色出現(xiàn)為陰性反應(yīng)。本試驗可用未接種的P D P 瓊脂培養(yǎng)基斜面作陰性對照，陰性對照試驗應(yīng)當(dāng)呈陰性。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應(yīng)于室溫培養(yǎng)12天再按上法試驗。凡經(jīng)再次檢驗，綠膿菌素試驗仍為陰性者應(yīng)繼續(xù)以下試驗。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置3035

35、°C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反應(yīng)，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。小倒管內(nèi)無氣泡者為陰性反應(yīng)。42°C生長試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0 . 9 %無菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，立即置41°C士1°C的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使整個斜面浸沒在水浴中，培養(yǎng)2448h,斜面如有菌苔生長者為陽性反應(yīng);無菌苔生長為陰性反應(yīng)。明膠液化試驗以接種計沾取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應(yīng)接近培養(yǎng)基的底部，于3035°C培養(yǎng)24h。取

36、出放入04°C冰箱內(nèi)1030min。如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性反應(yīng);如明膠呈凝固狀，為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)注意：( 1 )本試驗接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種。( 2 )試驗應(yīng)同時設(shè)未接種細(xì)菌的陰性對照管，與試驗管同時培養(yǎng)并觀察結(jié)果。6.4.2.3金黃色葡萄球菌試驗組：取1：10供試液10ml和金黃色葡萄球菌懸液1ml，接種至100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。陽性對照試驗：取金黃色葡萄球菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出金黃色葡萄球菌。陰性對照試驗

37、：取稀釋液10ml，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。金黃色葡萄球菌的試驗：按上述分組，置3035培養(yǎng)1824h(必要時可延至48h)。陰性對照應(yīng)無菌生長。將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置3035培養(yǎng)2472h。當(dāng)供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于金黃色葡萄球菌特征，可報告為lg或lml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。純培養(yǎng)當(dāng)供試品分離平板生長菌落與表1 所列菌落特征相似或疑似時，應(yīng)選取2 3 個以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，于3035°

38、;C培養(yǎng)1824h，取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭染色、鏡檢及接種營養(yǎng)瓊脂肉湯于3035°C培養(yǎng)182 4 h做血漿凝固酶試驗。革蘭染色、鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌,無芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。血漿凝固酶試驗試管法:取無菌試管（l O m m X 1 0 0 m m ) 3支，各加人血漿和0. 9 % 無菌氯化鈉溶液（1 : 1)0. 5ml, 1 支加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液(或被檢菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液>0. 5 m l，其余2 支作對照管：1 支加入金黃色葡萄球菌 C M C C ( B ) 2 6 0 0 3 培養(yǎng)物菌懸液或營

39、養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0. 5 ml作為陽性對照;另一支加入營養(yǎng)肉湯或0. 9 % 無菌氯化鈉溶液0. 5 m l作陰性對照。三管同時置37°C水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3 h后開始檢查，以后每隔適當(dāng)時間觀察一次，直至24h。檢査時，輕輕將試管傾斜（動作勿大），仔細(xì)觀察，陰性對照管血漿流動自如，陽性對照管血漿呈凝固狀，試驗管呈凝固者為陽性反應(yīng);不凝固為陰性反應(yīng)。陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。7異常情況處理嚴(yán)格按照微生物限度檢查法SOP操作，如在檢測中出現(xiàn)不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問題原因后，決定是否需對本方案中設(shè)定的大豆磷脂的微生物限度檢查方法進(jìn)行修改，并重新進(jìn)行驗證。8測試結(jié)果8.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果見附表1。8.2控制菌的檢查方法驗證結(jié)果見附表25。8.3按確定的驗證方法檢驗三批產(chǎn)品微生物限度檢查結(jié)果見附表6。9結(jié)論9.1按照大豆磷脂檢驗操作規(guī)程，我們設(shè)定了該產(chǎn)品的微生物限度檢驗方法，