實(shí)驗(yàn)六質(zhì)粒dna的制備ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 堿變性法小量制備質(zhì)粒堿變性法小量制備質(zhì)粒DNADNA 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊粚?shí)驗(yàn)?zāi)康膚掌握堿變性裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理。w掌握DNA分別純化的根本操作技藝。二實(shí)驗(yàn)背景二實(shí)驗(yàn)背景質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的環(huán)形雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主的進(jìn)展復(fù)制。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋方式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。大小可從1kb到200kb。The constructed E. coli plasmid pBR322. 質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如分開(kāi)宿主細(xì)胞那么不能存活，而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。 質(zhì)粒的存在使宿主具有一

2、些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性或致育因子等。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型： 松弛型質(zhì)粒 和 嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒 其復(fù)制不需求質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶。質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常很高，有的甚至可達(dá)2000-3000拷貝/細(xì)胞。2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒 嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制遭到嚴(yán)厲控制，其拷貝數(shù)通常很低，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子 。質(zhì)粒的運(yùn)用 大多數(shù)基因工程運(yùn)用松弛型質(zhì)粒。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。 質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的

3、重要媒介物， 這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的運(yùn)用價(jià)值。-四個(gè)載體酶切圖分別質(zhì)粒DNA方法 從大腸桿菌中分別質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：堿變性法；煮沸法；羥基磷灰石層析法等 各方法分別是根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及構(gòu)造等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,銜接與轉(zhuǎn)化。差速離心differential centrifugation是利用不同離心速度產(chǎn)生的不同離心力，將沉降系數(shù)不同的各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開(kāi)。用于分別大小、外形顯著不同的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分別.特點(diǎn)：1介質(zhì)密度均一；2速度由低向高，逐級(jí)離心。沉降順序

4、：核線粒體溶酶體與過(guò)氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體核蛋白體?？蓪⒋笮∠嗖顟沂獾募?xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步經(jīng)過(guò)密度梯度離心再行分別純化。 差速離心 dx 2r2 (p-m) dx 2r2 (p-m)V= = . 2 XV= = . 2 X dt 9 dt 9 d2 (p-m) d2 (p-m) = . 2 X = . 2 X 18 18r r： 球形粒子的半徑球形粒子的半徑 d d：球形粒子的直徑：球形粒子的直徑：流體介質(zhì)的粘度數(shù)：流體介質(zhì)的粘度數(shù) pp：粒子的密度：粒子的密度mm：介質(zhì)的密度：介質(zhì)的密度差速離心差速離心高速高速低速低速三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理堿變性法根本原理堿變性法根本原理 堿裂解

5、法是一種運(yùn)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差別而到達(dá)分別目的。 在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋構(gòu)造解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分別， 當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)理其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保管在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而構(gòu)成纏連的網(wǎng)狀構(gòu)造， 經(jīng)過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一同沉淀下來(lái)而被除去。而質(zhì)粒DNA仍為可溶形狀留在上清中。四、操作步驟四、操作步驟 分別質(zhì)粒DNA的方法普通包括3個(gè)根本步驟： 培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 搜集和裂解細(xì)菌； 分別和純化質(zhì)粒DNA。 思索題思索