臨床醫(yī)學(xué)檢驗新技術(shù)

1、熒光定量PCR 所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 技術(shù)原理：將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得CT值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。 臨床應(yīng)用：各型肝炎

2、、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。檢測種類涉及多種病原體，從細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體、真菌、立克次體、螺旋體到寄生蟲。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。技術(shù)原理：將待測細(xì)胞經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力

3、下進(jìn)入充滿鞘液的流動室。在液的約束下細(xì)胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱，后者與入射的激光束垂直相交，液柱中的細(xì)胞被激光激發(fā)產(chǎn)生熒光。儀器中一系列光學(xué)系統(tǒng)（透鏡、光闌、濾片和檢測器等）收集熒光、光散射、光吸收或細(xì)胞電組抗等信號，計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行收集、儲存、顯示并分析被測定的各種信號，對各種指標(biāo)做出統(tǒng)計分析。臨床應(yīng)用：可用于白血病的分型、腫瘤細(xì)胞染色體的異倍性測定，以及免疫學(xué)研究，并已開始用于細(xì)菌鑒定，病毒感染細(xì)胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細(xì)胞的記數(shù)。FCM通過熒光抗原抗體檢測技術(shù)對細(xì)胞表面抗原分析，進(jìn)行細(xì)胞分類和亞群分析。這一技術(shù)對于人體細(xì)胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治

4、療有重要作用。目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經(jīng)發(fā)展到了百余種，可以對各種血細(xì)胞和組織細(xì)胞的表型進(jìn)行測定分析。一、 在血液病診斷和治療中的應(yīng)用FCM通過對外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病等各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。二、 在血栓與出血性疾病中的應(yīng)用FCM可以通過單抗免疫熒光標(biāo)記(血小板膜糖蛋白b/a,CD62，CD63等)監(jiān)測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。而用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測的非免疫性指標(biāo)。FCM可以測定血小板相關(guān)抗體含量，用于診斷及治療監(jiān)測，具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

5、酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技術(shù)自20 世紀(jì)70年代初問世以來，發(fā)展非常迅速，目前被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等許多領(lǐng)域。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。技術(shù)原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相免疫測定技術(shù)，其先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶

6、反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有雙抗體夾心法、間接法、競爭法三種類型的常用方法。臨床應(yīng)用：ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。1、病原體及其抗體的檢測病毒感染如肝炎病毒，巨細(xì)胞病毒，風(fēng)疹病毒，皰疹病毒，輪狀病毒，艾滋病病毒（HIV）等。細(xì)菌感染如鏈球菌，布氏桿菌等。寄生蟲感染如阿米巴、弓形蟲、錐蟲等。 2、蛋白質(zhì)如各種免疫球蛋白，腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺堿性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如

7、肌酸激酶-MB，其他蛋白質(zhì)如鐵蛋白等。 3、非肽類激素如T3, T4，雌二醇，皮質(zhì)醇等。 4、藥物治療心臟病藥物如地高辛，抗哮喘藥物如茶堿，抗生素如慶大霉素等。免疫印跡技術(shù)免疫印跡法 (Western blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)基本原理：免疫印跡與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Western blot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高

8、和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。臨床應(yīng)用：免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。用免疫印跡技術(shù)可定性、定量地檢測出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分，對于一些能感染細(xì)胞而細(xì)胞病變不易觀察的病原體的檢測也很有用。用單克隆抗體做為第一抗體進(jìn)行免疫印跡，還可以對毒株做分型研究。時間分辨熒光分析法時間分辨熒光分析法（Time resolved fluoroisnmuno a

9、ssay,TRFIA）是近十年發(fā)展起來的非同位素免疫分析技術(shù)，是目前最先進(jìn)的免疫檢測技術(shù)。技術(shù)原理：使用三價稀土離子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結(jié)構(gòu)的螯合劑以及抗原形成稀土離子-螯合劑-抗原螯合物。當(dāng)標(biāo)記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫復(fù)合物，由于免疫復(fù)合物中抗原抗體結(jié)合部分就含有稀土離子，當(dāng)采取一些辦法將結(jié)合部分與游離部分分開后，利用時間分辨熒光分析儀，即可測定復(fù)合物中的稀土離子發(fā)射的熒光強(qiáng)度，從而確定待測抗原的量。正常情況下，免疫復(fù)合物中的稀土離子自身熒光信號很微弱，若加入一種酸性增強(qiáng)液，稀土離子從免疫復(fù)合物中解離出來，和增強(qiáng)液中

10、的-二酮體、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一種微囊。后者被激發(fā)光激發(fā)后，則稀土離子可以發(fā)出長壽命的極強(qiáng)的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強(qiáng)將近100萬倍。采用時間分辨技術(shù)測量熒光，采用了門控技術(shù)，它是使背景熒光信號降低到零以后，再測定長壽命標(biāo)記物的熒光。臨床應(yīng)用：時間分辨熒光免疫分析可用來檢測生物活性物質(zhì)。在內(nèi)分泌激素的檢測，腫瘤標(biāo)志物的檢測，抗體檢測，病毒抗原分析，藥物代謝分析以及各種體內(nèi)或外源性超微量物質(zhì)的分析中，應(yīng)用TRFIA法越來越普遍。近年來，已將這項技術(shù)應(yīng)用于核酸探針分析和細(xì)胞活性分析、生物大分子分析，發(fā)展十分迅速。一、TRFIA法在內(nèi)分泌學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)分泌激素是

11、一些活性小分子，它們能與適當(dāng)?shù)目贵w反應(yīng)，具有免疫反應(yīng)性，但不能產(chǎn)生抗體，不具有免疫原性，它們屬于半抗原。對這些半抗原的測定，一般多用競爭性時間分辨熒光免疫法測定。這方面的測定主要有血清中孕酮、雌二醇、睪酮、甲狀腺激素、前列腺素的測定等等。二、TRFIA在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用對一些完全抗原，它們大多是既有免疫反應(yīng)性又有免疫原性的蛋白質(zhì)類，主要包括促甲狀腺激素、血清胰島素、血清癌胚抗原、血清甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等，主要采用非競爭性TRFIA法進(jìn)行測定。三、TRFIA法在免疫學(xué)中的應(yīng)用某些免疫細(xì)胞（如NK、LAK、T殺傷細(xì)胞等）的活性，可以用TRFIA法來檢測。四、TRFIA法在微生物學(xué)中的應(yīng)用目前

12、TRFIA已廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒、腦炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞體病毒（RSV）、副粘病毒、風(fēng)疹病毒、馬鈴薯病毒、輪狀病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）、出血熱病毒和梅毒螺旋體的抗原抗體以及某些細(xì)菌和寄生蟲抗體的檢測。最近,潘利華等用TRFIA法進(jìn)行了人血清中丙型肝炎病毒抗體(Anti-HCV)的檢測，效果明顯高于酶聯(lián)免疫法。飛行時間質(zhì)譜技術(shù)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，給臨床腫瘤早期標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)帶來了劃時代的革命，它將傳統(tǒng)的通常一次只能測定一個蛋白標(biāo)志物革命性地發(fā)展到一次可測定數(shù)十個，甚至數(shù)百個蛋白，同時極大的提高了診斷的靈敏度和特異性。技術(shù)原理：質(zhì)譜儀需要在真空情況下運(yùn)轉(zhuǎn)，用以保護(hù)檢測器，同時提

13、高測量精度。在實際使用中，一個微孔需要被使用。儀器中氣體樣本首先通過微孔取樣，然后到達(dá)離子源，有脈沖電場送入飛行時間模塊。然后使用垂直于送入方向的脈沖電場對離子進(jìn)行加速。這樣做的主要目的是確定所有離子在水平方向沒有初速度。在U型飛行之后，達(dá)到傳感器。不同離子到達(dá)傳感器的時間不同，借此來選擇m/z。通常的假設(shè)認(rèn)為離子只能帶一個電荷，如此，得到的信號，直接對應(yīng)檢測到離子的相對原子質(zhì)量。臨床應(yīng)用：在腫瘤早期診斷中的研究進(jìn)展液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時間質(zhì)譜測定和軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模型，可對潛在的生物標(biāo)記物

14、進(jìn)行鑒定?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性。技術(shù)原理：化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時, 同時發(fā)射出光子(hM) , 利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標(biāo)記在抗

15、原(化學(xué)發(fā)光免疫分析) 或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析) 上, 或酶作用于發(fā)光底物。臨床應(yīng)用：用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物腫瘤標(biāo)記物、內(nèi)分泌功能、傳染性疾病等多種檢測項目。生物芯片生物芯片技術(shù)起源于核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質(zhì)、糖分子、組織等）的微陣列雜交型芯片，陣列中每個分子的序列及位置都是已知的，并且是預(yù)先設(shè)定好的序列點陣。技術(shù)原理：生物芯片是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。狹義的生

16、物芯片概念是指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點陣。臨床應(yīng)用：從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。免疫濁度法免疫濁度法本質(zhì)上屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，其特點是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器、自動化檢測系統(tǒng)和免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合，可進(jìn)行液體中

17、微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測。技術(shù)原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在兩者比例合適時，抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，如形成的復(fù)合物增加，反應(yīng)液的濁度隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出受檢物的含量。臨床應(yīng)用：1、免疫功能監(jiān)測：免疫球蛋白G、A、M，免疫球蛋白輕鏈、，補(bǔ)體C3、C4測定。 2、心血管疾病監(jiān)測:載脂蛋白A、B，脂蛋白(a)，C-反應(yīng)蛋白等。 3、炎癥狀況監(jiān)測:C-反應(yīng)蛋白，a-酸性糖蛋白，觸珠蛋白，銅藍(lán)蛋白等。 4、風(fēng)濕性疾病檢測：ASO、RF、CRP 5、腎臟功能檢測：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，-微球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，免疫球蛋白G等。 6

18、、營養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測：白蛋白，前白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等。 7、凝血及出血性疾病的檢測：抗凝血酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白，觸珠蛋白等。 8、血腦屏障監(jiān)測：腦脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、M。免疫熒光標(biāo)記技術(shù)技術(shù)原理：利用物質(zhì)吸收光能后，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)而發(fā)光的特性。將具有這種特性的熒光素（異硫氰熒光黃或羅丹明B200)用化學(xué)方法結(jié)合在特異的抗體或抗原上，又不損害其抗體或抗原活性的一種熒光顯微鏡下的示蹤技術(shù)?？贵w與抗原的結(jié)合是高度特異的，所以只要知道其中的一種因子，也就知道了另一種因子。技術(shù)特點：1、特異的抗原抗體反應(yīng)，并與形態(tài)學(xué)相結(jié)合，增加試驗的特異性和敏感性。2、利用了物理、化學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)等綜合性技術(shù)，使免疫

19、熒光技術(shù)成為一種獨立完整的一門方法學(xué)。3、一種熒光抗體可以檢查多種抗原抗體復(fù)合物。4、只要知道一種抗體或抗原，就可以知道其對應(yīng)的抗原或抗體。臨床應(yīng)用：1、在細(xì)菌診斷中的應(yīng)用：主要用于鑒定細(xì)菌和對抗原結(jié)構(gòu)的研究。如對甲型鏈球菌的快速診斷和分型鑒定，腦膜炎雙球菌的快速診斷等。2、在寄生蟲學(xué)診斷中的應(yīng)用：可用已知的寄生蟲抗原，檢查血清中的抗體，用于寄生蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。也可用于寄生蟲感染的免疫學(xué)和發(fā)病機(jī)理等方面的研究。3、在病毒學(xué)診斷中的應(yīng)用：快速診斷中對流感病毒、乙腦、狂犬病、脊髓灰白質(zhì)炎、恙蟲病等的快速檢出；也可用來檢查血清中的抗病毒抗體。4、在免疫病理方面的應(yīng)用：檢查球蛋白的沉積，特別

20、是對于復(fù)合物病如：腎小球腎火、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等利用補(bǔ)體熒光法測定復(fù)合物沉著的位置，以了解病變侵犯部位和病變基礎(chǔ)。5、血液中B及T細(xì)胞的鑒定。6、激素和酶的局部組織定位。7、一些器官移植抗原鑒定。8、組織中免疫球蛋及補(bǔ)體組分的檢測。9、在診斷自身免疫病方面的應(yīng)用：(1)抗核抗體（ANA)：是自身免疫性疾病最常出現(xiàn)的一種抗體，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡，陽性率更高。其它如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦可出現(xiàn)較高效價的抗體。（2）抗線粒體抗體：在慢性活動性肝炎患者中，如抗體效價在1：256以上可以認(rèn)為是自身免疫性肝炎。原發(fā)性膽汁性肝硬化約有98出現(xiàn)線粒體抗體，慢性活動性肝炎在31左右。線粒體抗體在膠原性疾病中可見（2-8）且效價遠(yuǎn)較自身免疫性肝炎低。（3）抗平滑肌抗體：這是對平滑肌組織的特異性抗體，沒有器官和種屬特異性。其臨床意義對于自身免疫性肝炎約82，急性肝炎早期也可出現(xiàn)抗平滑肌抗體