植物組織培養(yǎng)的基本原理

1、一、植物細(xì)胞全能性一、植物細(xì)胞全能性（totipotencytotipotency） 1 1、植物細(xì)胞全能性：、植物細(xì)胞全能性：19021902年由年由haberlandthaberlandt提出，提出，即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。發(fā)育成完整植株的能力。 2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代，認(rèn)為每一個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的年代，認(rèn)為每一個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不傳信息，分化出

2、植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。 植物細(xì)胞全能性的證明是通過(guò)植物細(xì)胞全能性的證明是通過(guò)19581958年年stewardsteward等胡蘿等胡蘿卜根段細(xì)胞體胚發(fā)生試驗(yàn)及卜根段細(xì)胞體胚發(fā)生試驗(yàn)及19641964年年guhaguha等進(jìn)行的曼陀羅等進(jìn)行的曼陀羅花藥培養(yǎng)。花藥培養(yǎng)。從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株2 2、全能性表達(dá)：、全能性表達(dá)：少數(shù)體細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中可能丟失少數(shù)體細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中可能丟失或增加一部分遺傳物質(zhì)或增加一部分遺傳物質(zhì), ,因而失去全能性。如篩管細(xì)胞因而失去全能性

3、。如篩管細(xì)胞, ,它在發(fā)育過(guò)程中失去細(xì)胞核它在發(fā)育過(guò)程中失去細(xì)胞核, ,因而沒(méi)有全能性。因而沒(méi)有全能性。 由于目前還無(wú)法使所有的離體植物細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)其全由于目前還無(wú)法使所有的離體植物細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)其全能性。多數(shù)情況下只是分生組織等的細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)。能性。多數(shù)情況下只是分生組織等的細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)。 離體材料在一定條件下仍將按原有的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系進(jìn)離體材料在一定條件下仍將按原有的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系進(jìn)行生命活動(dòng)，表現(xiàn)其全能性。行生命活動(dòng)，表現(xiàn)其全能性。 決定決定( (determination)determination)：植物體是由各個(gè)層次或小系植物體是由各個(gè)層次或小系統(tǒng)如基因水平、細(xì)胞水平、器官水平構(gòu)成的生命大系統(tǒng)，

4、統(tǒng)如基因水平、細(xì)胞水平、器官水平構(gòu)成的生命大系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間協(xié)調(diào)運(yùn)行不僅是維持植物生長(zhǎng)的先決條系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間協(xié)調(diào)運(yùn)行不僅是維持植物生長(zhǎng)的先決條件，而且它們的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系還制約著其發(fā)育進(jìn)程。件，而且它們的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系還制約著其發(fā)育進(jìn)程。 全能性表達(dá)條件之一：細(xì)胞的孤立全能性表達(dá)條件之一：細(xì)胞的孤立是誘發(fā)全能性表達(dá)是誘發(fā)全能性表達(dá)的重要因素。的重要因素。 脫分化脫分化（dedifferentiationdedifferentiation）：已分化的植物細(xì)胞：已分化的植物細(xì)胞要表達(dá)全能性要表達(dá)全能性, ,必需先脫分化必需先脫分化, ,使細(xì)胞恢復(fù)到胚性階段。使細(xì)胞恢復(fù)到胚性階段。 生長(zhǎng)素尤其是生長(zhǎng)

5、素尤其是2,4-2,4-對(duì)脫分化具有重要作用。對(duì)脫分化具有重要作用。 2,4-2,4-濃度高時(shí)濃度高時(shí), ,誘發(fā)不均等分裂；而濃度低時(shí)誘發(fā)不均等分裂；而濃度低時(shí), ,只只誘發(fā)均等分裂誘發(fā)均等分裂。一旦發(fā)生不均等分裂。一旦發(fā)生不均等分裂, ,細(xì)胞就對(duì)生長(zhǎng)素細(xì)胞就對(duì)生長(zhǎng)素失去敏感性失去敏感性, ,在無(wú)生長(zhǎng)素的條件下能自發(fā)形成體細(xì)胞胚。在無(wú)生長(zhǎng)素的條件下能自發(fā)形成體細(xì)胞胚。l全能相對(duì)性的啟發(fā)在離體培養(yǎng)的選材上，盡可能全能相對(duì)性的啟發(fā)在離體培養(yǎng)的選材上，盡可能選取分生組織的部位。選取分生組織的部位。l將實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c外植體生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)將實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c外植體生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)(“(“決定決定”狀態(tài)狀態(tài)) )相結(jié)合，創(chuàng)

6、造良好的離體條件。相結(jié)合，創(chuàng)造良好的離體條件。l合理使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。合理使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。1、概念、概念 （1） 分化：是指植物體各個(gè)部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，分化：是指植物體各個(gè)部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化。包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化。 （2）細(xì)胞分化：指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能）細(xì)胞分化：指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過(guò)程。改變或潛在的發(fā)育方式改變的過(guò)程。 細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是植株離細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是植株離體再生的基礎(chǔ)。體再生的基礎(chǔ)。 （1） 細(xì)胞分化基本分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化細(xì)胞

7、分化基本分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。 （2）分化與極性（）分化與極性（polarity）關(guān)系密切。）關(guān)系密切。 （3）生理隔離或機(jī)械隔離在細(xì)胞分化中有促進(jìn)作用。）生理隔離或機(jī)械隔離在細(xì)胞分化中有促進(jìn)作用。 （4） 細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。（5）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長(zhǎng)）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長(zhǎng)素與分裂素比值，高，促進(jìn)生根；低，芽。素與分裂素比值，高，促進(jìn)生根；低，芽。（6）染色體和）染色體和dna的變化對(duì)細(xì)胞分化影響較大。的變化對(duì)細(xì)胞分化影響較大。如如d

8、na 差異復(fù)制。差異復(fù)制。新種的特征帶新種的特征帶ssr 譜帶變異譜帶變異在dna水平復(fù)制上的差異穎果作外植體穎果作外植體. 愈傷組織分化芽愈傷組織分化芽一、脫分化（一、脫分化（dedifferentiation） 1、概念：、概念： 也稱去分化，指離體條件下生長(zhǎng)細(xì)胞、組織或也稱去分化，指離體條件下生長(zhǎng)細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和器官經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或不分化細(xì)胞的過(guò)程。愈傷組織或不分化細(xì)胞的過(guò)程。 如葉柄基部的薄壁細(xì)胞成為離層細(xì)胞；傷害導(dǎo)如葉柄基部

9、的薄壁細(xì)胞成為離層細(xì)胞；傷害導(dǎo)致局部細(xì)胞形成愈傷組織。致局部細(xì)胞形成愈傷組織。 機(jī)理尚未完全闡明。一般認(rèn)為脫分化過(guò)程中細(xì)胞機(jī)理尚未完全闡明。一般認(rèn)為脫分化過(guò)程中細(xì)胞膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖體形成，過(guò)氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活體形成，過(guò)氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。躍等。黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織（1 1）損傷。）損傷。 切割損傷的刺激，促使細(xì)胞增殖。切割損傷的刺激，促使細(xì)胞增殖。 （2 2）在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)常加入生長(zhǎng)素類，但同時(shí)配合細(xì)）在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)常加入生

10、長(zhǎng)素類，但同時(shí)配合細(xì)胞分裂素的效果可能更好。胞分裂素的效果可能更好。 （3 3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。 （4 4）細(xì)胞位置）細(xì)胞位置. . 外植體本身的各類細(xì)胞可能對(duì)培養(yǎng)條件外植體本身的各類細(xì)胞可能對(duì)培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。的刺激有不同的敏感性。（5 5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會(huì)）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會(huì)有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。（6 6）植物種類的差異。）植物種類的差異。 一般雙子葉植物比單子葉植物一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。及裸子植物容易。不同部位產(chǎn)生不同脫分化

11、效果不同部位產(chǎn)生不同脫分化效果1、概念、概念 ：指離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化指離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株?？?、器官，甚至形成完整植株。（1）細(xì)胞水平再分化：首先是細(xì)胞壁變厚、假導(dǎo)管細(xì)胞）細(xì)胞水平再分化：首先是細(xì)胞壁變厚、假導(dǎo)管細(xì)胞的形成，以及酶水平的變化和明顯的機(jī)能分化，從而形的形成，以及酶水平的變化和明顯的機(jī)能分化，從而形成各種類型的細(xì)胞。成各種類型的細(xì)胞。（2）組織水平再分化：在高水平生長(zhǎng)素條件下，最常見(jiàn)）組織水平再分化：在高水平生長(zhǎng)素條件下，最常見(jiàn)

12、的是維管組織（的是維管組織（vascular tissue）的分化）的分化. 松散的愈傷組松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。 依起源不同，分器官型（依起源不同，分器官型（organ ）和器官發(fā)生型）和器官發(fā)生型（organogenesis ）。）。器官型：直接由外植體細(xì)胞形成器官原基，繼而發(fā)育成器官型：直接由外植體細(xì)胞形成器官原基，繼而發(fā)育成器官；器官；器官發(fā)生型：外植體先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)器官發(fā)生型：外植體先形成愈傷組織，再由

13、愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基。生不同的器官原基。 根和莖（包括其變態(tài)器官）或芽器官根和莖（包括其變態(tài)器官）或芽器官的發(fā)生可使植株重建。的發(fā)生可使植株重建。v器官發(fā)生再生植株的方式大致有：器官發(fā)生再生植株的方式大致有： a 先形成芽，芽的基部后產(chǎn)生根；先形成芽，芽的基部后產(chǎn)生根； b 先形成根，根上再出芽；先形成根，根上再出芽； c 愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來(lái)組織把兩者結(jié)合起來(lái).v一些變態(tài)莖、葉器官，離體培養(yǎng)易于形成相應(yīng)的變一些變態(tài)莖、葉器官，離體培養(yǎng)易于形成相應(yīng)的變態(tài)器官。態(tài)器官。 2、影響細(xì)胞再分化因素：、影響細(xì)胞

14、再分化因素： 從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)再分化可獲從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)再分化可獲 得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能使所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要目前，還不能使所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要原因是：原因是： （1）不同植物種類再分化的能力差異較大；）不同植物種類再分化的能力差異較大； （2）對(duì)某些植物再生條件還沒(méi)有完全掌握。）對(duì)某些植物再生條件還沒(méi)有完全掌握。 1、愈傷組織形成、愈傷組織形成 在脫分化的過(guò)程中，多形成在脫分化的過(guò)程中，多形成callus, 其細(xì)胞結(jié)構(gòu)多是異質(zhì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)多是異質(zhì)性的，無(wú)明

15、顯極性。性的，無(wú)明顯極性。（1）誘導(dǎo)期：）誘導(dǎo)期：細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂，細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂， 細(xì)胞大小幾乎不變，細(xì)胞大小幾乎不變，生理生化變化大，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。生理生化變化大，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。（2）分裂期：）分裂期：外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞會(huì)發(fā)生分化，及時(shí)轉(zhuǎn)移，其可無(wú)限制地原培養(yǎng)基上，細(xì)胞會(huì)發(fā)生分化，及時(shí)轉(zhuǎn)移，其可無(wú)限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)。進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)。（3）分化期：）分化期：停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生

16、理代謝變化，出現(xiàn)停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異細(xì)胞。形態(tài)和功能各異細(xì)胞。 （1）生長(zhǎng)：誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞分裂，在組織）生長(zhǎng)：誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞分裂，在組織受傷表面形成一層愈傷組織，受傷表面形成一層愈傷組織， callus的細(xì)胞數(shù)目迅速增的細(xì)胞數(shù)目迅速增多，表層細(xì)胞多，表層細(xì)胞平均重量下降，體積變小平均重量下降，體積變??；降低溫度，可；降低溫度，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，平均大小可增加。以使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，平均大小可增加。 （2）質(zhì)地類型：松脆和致密兩種。）質(zhì)地類型：松脆和致密兩種。 高濃度生長(zhǎng)素，可高濃度生長(zhǎng)素，可使使callus變得松脆；高濃度細(xì)胞分裂素，則可

17、使致密。變得松脆；高濃度細(xì)胞分裂素，則可使致密。 （3）生理生化變化：）生理生化變化： rna，同工酶譜帶，次生物質(zhì)合成能力，對(duì)激素的馴，同工酶譜帶，次生物質(zhì)合成能力，對(duì)激素的馴化（化（1年或繼代培養(yǎng)年或繼代培養(yǎng)10代以上）。代以上）。 在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時(shí)在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，間的延長(zhǎng)，callus長(zhǎng)勢(shì)下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生長(zhǎng)勢(shì)下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低甚至死亡。能力下降、降低甚至死亡。 主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變；主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變； 生生理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對(duì)外源理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對(duì)外源生長(zhǎng)物質(zhì)的敏感性改變生長(zhǎng)物質(zhì)的敏感性改變. 后者可以通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)條件而后者可以通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)?；謴?fù)。l（1）過(guò)程：外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部較）過(guò)程：外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向