11流式細胞技術

1、流式細胞技術與流式細胞儀流式細胞技術與流式細胞儀flow cytometry &flow cytometer(fcm) 主要內(nèi)容主要內(nèi)容p基本原理基本原理p基本結構基本結構p主要性能指標主要性能指標p臨床應用臨床應用流式細胞儀的發(fā)展簡史流式細胞儀的發(fā)展簡史p19341934年年moldavanmoldavan 使懸浮的血紅細胞從一個使懸浮的血紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞儀的最初模型。儀的最初模型。p19471947年，年，guckergucker首次采用鞘流原

2、理對氣體首次采用鞘流原理對氣體中的微粒進行計數(shù)。中的微粒進行計數(shù)。p19531953年，年，crosland-taylorcrosland-taylor利用同一原理，利用同一原理，成功的設計了一種鞘流系統(tǒng)，配合光電技成功的設計了一種鞘流系統(tǒng)，配合光電技術對紅細胞進行計數(shù)。術對紅細胞進行計數(shù)。p19691969年年van dillavan dilla 和和los alamoslos alamos采用了采用了crosland-taylorcrosland-taylor設計的層流流動室和氬離子設計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者

3、互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流三者互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流式細胞測量儀的基礎。式細胞測量儀的基礎。p19721972年年，數(shù)位研究者在斯坦佛大學研制了一，數(shù)位研究者在斯坦佛大學研制了一臺熒光激活細胞分選儀，它標志著流式細胞儀臺熒光激活細胞分選儀，它標志著流式細胞儀商品化時代的真正到來。商品化時代的真正到來。19741974年，年，bdbd公司正式公司正式投產(chǎn)，商品名投產(chǎn)，商品名facs-1facs-1tmtm. .p目前的主流生產(chǎn)商，目前的主流生產(chǎn)商，美國的美國的bdbd公司、公司、coultercoulter公司。公司。一、流式細胞儀的基本原理一、流式細胞儀的基本原理單細胞

4、液柱單細胞液柱已標記的單細已標記的單細胞懸液和鞘液胞懸液和鞘液硅化管硅化管流動室流動室噴嘴噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)散射光感受系統(tǒng)收集光信號收集光信號熒光染料被熒光染料被激發(fā)發(fā)光激發(fā)發(fā)光光電倍增管光電倍增管脈沖信號脈沖信號計算機系統(tǒng)計算機系統(tǒng)分析結果分析結果放大放大垂直相交垂直相交形成穩(wěn)態(tài)形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之水平激光與之細胞組成細胞組成細胞功能細胞功能大小大小細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細胞活性細胞活性dna, rnadna, rna含量含量胞內(nèi)細胞因子胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結合位點激素結合位點鈣離子鈣離子, ph,

5、ph值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性流式細胞儀常檢測的細胞特性fcmfcm的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）何形成單個細胞流） 通過流式細胞儀進行細胞分選通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。進一步培養(yǎng)和研究時進行的。（二）流式細胞儀的分選原理（二）流式細胞儀的分選原理細胞懸液形成液流柱細胞懸液形成液流柱流動室振動流動室振動液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細胞的液滴含細胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機械振動機械振動不充電不充電充

6、電充電分選基本原理分選基本原理二、流式細胞儀的基本結構二、流式細胞儀的基本結構p流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)p激發(fā)光源及光束成形系統(tǒng)激發(fā)光源及光束成形系統(tǒng)p光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)p信號檢測和存儲系統(tǒng)信號檢測和存儲系統(tǒng)p顯示分析系統(tǒng)顯示分析系統(tǒng)p細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)（一）流動室（一）流動室p是是fcm的核心部件，由的核心部件，由石英玻璃制成，并在石石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑英玻璃中央開一個孔徑為為 的長方形的長方形孔，供單個細胞通過，孔，供單個細胞通過，檢測區(qū)在該孔的中心或檢測區(qū)在該孔的中心或下方。下方。p流動室內(nèi)充滿了鞘流，流動室內(nèi)充滿了鞘流，其作用是將樣品流環(huán)包。其作

7、用是將樣品流環(huán)包。umum 180430鞘流原理鞘流原理p細胞懸液流過檢測光束，約細胞懸液流過檢測光束，約30%的細胞在的細胞在流動中明顯偏離軸心，有向流速較慢的區(qū)流動中明顯偏離軸心，有向流速較慢的區(qū)域聚焦的趨勢。域聚焦的趨勢。p阻塞管路阻塞管路p聚焦的細胞直接影響測量結果聚焦的細胞直接影響測量結果p由于細胞偏離軸心造成其移動時間延長，降低由于細胞偏離軸心造成其移動時間延長，降低檢測速度。檢測速度。p激光束無法對準照射在細胞中心激光束無法對準照射在細胞中心鞘流原理鞘流原理p流動的液體可分為流動的液體可分為穩(wěn)流穩(wěn)流(層流層流)和和湍流湍流兩種狀態(tài)兩種狀態(tài)p層流原理層流原理：液體流動狀態(tài)有一個分界

8、點，即雷諾數(shù)：液體流動狀態(tài)有一個分界點，即雷諾數(shù)p 其定義為：在一個直徑為其定義為：在一個直徑為 的管子內(nèi)，液體的流速的管子內(nèi)，液體的流速為為v，密度為，密度為 ，黏滯系數(shù)為，黏滯系數(shù)為 ，p當當 時，液流處于層流狀態(tài)；當時，液流處于層流狀態(tài)；當 時，液時，液流處于湍流狀態(tài)。流處于湍流狀態(tài)。p流式細胞儀中要求標本處于層流狀態(tài)。常把流速限流式細胞儀中要求標本處于層流狀態(tài)。常把流速限制在制在10m/s10m/s以下。以下。erd/vdre2300er2300er鞘流原理鞘流原理p由此發(fā)展的鞘流技術，實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，由此發(fā)展的鞘流技術，實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，標本位于軸心穩(wěn)定流動，外面包被有

9、鞘液。標本位于軸心穩(wěn)定流動，外面包被有鞘液。p鞘流處于湍流狀態(tài)，圍繞標本噴嘴高速流動，這鞘流處于湍流狀態(tài)，圍繞標本噴嘴高速流動，這樣就使得標本流與鞘流形成穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)。樣就使得標本流與鞘流形成穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)。p由于標本噴嘴處于流動室的中心，就使得標本流由于標本噴嘴處于流動室的中心，就使得標本流在鞘流包被下，恒定處于同軸流動的中心位置，在鞘流包被下，恒定處于同軸流動的中心位置，其精度可以穩(wěn)定在幾個微米之內(nèi)。其精度可以穩(wěn)定在幾個微米之內(nèi)。p標本流的位置的穩(wěn)定可通過調(diào)整它與鞘液流速的標本流的位置的穩(wěn)定可通過調(diào)整它與鞘液流速的比例來實現(xiàn)，一般比例在比例來實現(xiàn)，一般比例在1:501:50到到1

10、 1：幾百之間：幾百之間。鞘流原理鞘流原理pbernoulli定律：當液體流經(jīng)截面不同的管道時，定律：當液體流經(jīng)截面不同的管道時，有有 ，s和和v分別是兩個管道的截面積分別是兩個管道的截面積和液體的流速。和液體的流速。2211vsvs鞘液流鞘液流動動方向方向lower pressurethe bernoulli effectvelocity gradient液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)（二）激光光源（二）激光光源p流式細胞儀的激發(fā)光源通常采用激光，通常流式細胞儀的激發(fā)光源通常采用激光，通常用的激光包括用的激光包括氬離子激光氬離子激光（488nm）、he-ne激光激光（633nm）和和半導體激光半導

11、體激光（635nm)。p由于細胞快速流動，通過光照區(qū)的時間只有由于細胞快速流動，通過光照區(qū)的時間只有1微秒左右，且細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)微秒左右，且細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激光出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激光光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光照強度。照強度。(二二)激光光源激光光源p激光光源的寬度大于被測細胞，為零分辨激光光源的寬度大于被測細胞，為零分辨率信號。率信號。p狹縫掃描技術：狹縫掃描技術：（三）光學系統(tǒng)（三）光學系統(tǒng)p主要元件為濾光片，分長通濾光片、短通主要元件為濾光片，分長通濾光片、短通濾光片、帶通

12、濾光片。濾光片、帶通濾光片。long (700nm)550 long pass (650lp)650 short pass (600sp)short (500nm)pass through filters600/100 band pass (600/100)transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)wavelengths blocked650 nm550 nm650 nmshort passlong passband passlong (700nm)550 long pass (650lp)650 short pass (600sp)short (500nm)

13、dichroic filterstransmitted 550 nmdiflected 90650 nm550 nm長波通雙色長波通雙色性反射鏡：性反射鏡：大于特定波大于特定波長的光通過長的光通過而將小于特定而將小于特定波長的光反射波長的光反射光學系統(tǒng)示意圖光學系統(tǒng)示意圖 細胞通過激光照射區(qū)時細胞通過激光照射區(qū)時 ，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間細胞為中心，向空間360360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散色光和度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散色光和熒光信號。熒光信號。（四）信號檢測系統(tǒng)（四）信號

14、檢測系統(tǒng)（四）信號檢測系統(tǒng)（四）信號檢測系統(tǒng)p散射光檢測散射光檢測p 前向光散射前向光散射（fsc, forward scatter ）p側向光散射側向光散射（ssc, side scatter ）p散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術( (如染色如染色) )，因此被稱為細胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。以上因此被稱為細胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。以上兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同。的波長相同。p熒光檢測熒光檢測(fluoresence detector)p（1 1）前向散射光）前向散射光：激光束照射細胞時

15、，光以激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度相對軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的信號向前方散射的信號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。細胞體積大小成正比。fals sensorlaser前向散射光示意圖前向散射光示意圖p（2 2）側向散射光：）側向散射光：激光束照射細胞時，光激光束照射細胞時，光以以9090角散射的信號，側向散射光對細胞膜、角散射的信號，側向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內(nèi)精細結構和顆粒性質(zhì)的信息細胞內(nèi)精細結構和顆粒性質(zhì)的信息。

16、fals sensor90ls sensorlaser側向散射光側向散射光示意圖示意圖 測得的測得的fsfs與與ssss信信號通過計算機處理，號通過計算機處理，可得到可得到fs-ssfs-ss圖，由圖，由此可僅用散射光信號此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進對未染色的活細胞進行分析或分選。行分析或分選。 此為血細胞分類此為血細胞分類的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子分析表面分子。淋巴細胞淋巴細胞單核細胞單核細胞中性粒細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 （3）熒光檢測）熒光檢測p熒光信號由被檢細胞上標記

17、的熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料特異性熒光染料受受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。p每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。p選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。的多個不同特征。p線性放大器和對數(shù)放大器線性放大器和對數(shù)放大器fitcfitctexas redte

18、xas redpe.pc.apcpe.pc.apcpecy5pecy5fl1fl1fl2fl2fl3fl3fl4fl4激光激光細細胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復合染料能量傳遞復合染料藻膽蛋白類藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料幾種常見的熒光染料（1）熒光信號的面積和寬度）熒光信號的面積和寬度 p所謂熒光信號的面積是所謂熒光信號的面積是采用對熒光光通采用對熒光光通量進行積分測量，一般對量進行積分測量，一般對dna含量測量含量測量時，均采用面積時，均采用面積(fl2a)來計算。這是來計算。這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準確反映

19、更能準確反映dna的含量。的含量。 p熒光信號的寬度熒光信號的寬度(如如fl2w)常用來區(qū)分常用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞雙聯(lián)體細胞 （2）熒光補償原理）熒光補償原理雙激光立體光路技術雙激光立體光路技術fsfs：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小ssss：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度flfl：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、一、 參數(shù)參數(shù)p單參數(shù)直方圖p雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖p三參數(shù)直方圖p多參數(shù)分析直分析方圖直分析方圖設門分析設門分析: :region和和gate設置設置二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式p gategate設置：

20、指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，設置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。p根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。多邊形門、任意形狀門和十字門。 設門分析技術設門分析技術 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計數(shù)與顆粒計數(shù)(count)構成，反映同樣散射光或熒光強構成，反映同樣

21、散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量細胞相對數(shù)量信道信道(channel )(channel )p雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。就可以確定細胞在圖上的表達位置。p雙參數(shù)信號雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光點圖利用顆粒密度反

22、映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點圖雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度綠色熒光強度紅色熒光強度紅色熒光強度雙參數(shù)直方圖點圖雙參數(shù)直方圖點圖2. 二維等高圖二維等高圖p由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。p等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。p曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細胞數(shù)愈多。p等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。二維等高圖二維等高圖3. 假三維等高圖假三維等高圖（三）三參數(shù)直方圖（三）三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和

23、散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析（六）細胞分選器（六）細胞分選器p細胞分選器由細胞分選器由水滴形成水滴形成、分選邏輯電路分選邏輯電路、水滴充電水滴充電和偏轉(zhuǎn)電路和偏轉(zhuǎn)電路組成。組成。p1.小水滴的形成小水滴的形成：液流從噴孔出來后，需要經(jīng)過一：液流從噴孔出來后，需要經(jīng)過一段距離才形成水滴。這段距離大概是段距離才形成水滴。這段距離大概是1020個波長個波長p噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。p2.邏輯電路：邏輯電路：為了分選細胞，需要細胞在經(jīng)過測量為了分選細胞，需要細胞在經(jīng)過測量區(qū)時，區(qū)時，fcm

24、判斷出哪個細胞滿足分選條件，并產(chǎn)生判斷出哪個細胞滿足分選條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號；一個邏輯信號；p此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖，當滿足分選條件的細胞形成水滴時，充電脈沖正好當滿足分選條件的細胞形成水滴時，充電脈沖正好對它進行充電。對它進行充電。p3.水滴的充電與偏轉(zhuǎn)水滴的充電與偏轉(zhuǎn)：當水滴從流束上將：當水滴從流束上將要斷開時，給含有這個水滴的流束充電，要斷開時，給含有這個水滴的流束充電，則水滴從流束上斷開后變帶有同極性的多則水滴從流束上斷開后變帶有同極性的多余表面電荷。余表面電荷。p下落的液滴通過一個由平行板電極形成的下落的液滴通過一個

25、由平行板電極形成的靜電場，水滴在電場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)電靜電場，水滴在電場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)電壓一般為壓一般為20006000v，對于高速分選偏轉(zhuǎn)，對于高速分選偏轉(zhuǎn)電壓可達電壓可達8000v。p分選速度：分選速度：單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸液中細胞的含量成正比。液中細胞的含量成正比。p分選純度：分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。的百分率。p分選收獲率：分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。p分選得率：分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。與分選速度成反比。分選的技術要求分選的技術要求三、主要性能指標三、主要性能指標p靈敏度靈敏度：衡量儀器檢測微弱熒光信號的重：衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標，以能檢測到的單個微球上最少標要指