細(xì)胞加力的實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞體外加力的實(shí)驗(yàn)方法研究目的 骨組織的主要功能結(jié)構(gòu)支撐。 力學(xué)刺激下，骨的結(jié)構(gòu)變化（骨生成和骨吸收），以適應(yīng)相應(yīng)的力學(xué)環(huán)境。 力學(xué)環(huán)境包括生物體外、體內(nèi)細(xì)胞之間的相互作用力和細(xì)胞內(nèi)張力等。力學(xué)系統(tǒng)。 目的：更好地理解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系及調(diào)節(jié)機(jī)制,必須結(jié)合力學(xué)觀點(diǎn)加以研究。 研究現(xiàn)狀實(shí)驗(yàn)方法： 在體環(huán)境：異常復(fù)雜,各類細(xì)胞各有特點(diǎn)，細(xì)胞之間關(guān)系復(fù)雜。 離體環(huán)境：細(xì)胞生理或病理現(xiàn)象的研究仍依賴于體外分離、培養(yǎng)。 人體細(xì)胞尺度在十幾至幾十個(gè)微米之間, 細(xì)胞膜的厚度僅有幾個(gè)納米至幾十個(gè)納米。因此, 常規(guī)的宏觀力學(xué)加載方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)無法直接使用。 細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究關(guān)鍵在于細(xì)胞的體外加載技術(shù)。在此基礎(chǔ)

2、上,通過顯微、攝像及計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng),對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及其形態(tài)變化進(jìn)行觀測(cè)與分析。體外細(xì)胞力學(xué)加載方法新近發(fā)展起來的方法包括:滴孔技術(shù)(pore)、探壓技術(shù)(poring technique)、懸浮技術(shù)(suspending technique)、激光捕息法(laser trap)、雙微滴管技術(shù)、流動(dòng)小室(flow chamber)和細(xì)胞過濾時(shí)間分析儀(cell transit timeanalyzer),基底應(yīng)變加載技術(shù)(substrate stretch loadingteehnies),細(xì)胞分子學(xué)加載技術(shù)(cell molecular loading technics)等。大體分為三類：

3、模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境的加載方法 模擬體外力學(xué)環(huán)境的加載方法 研究單細(xì)胞力學(xué)特性的加載方法 模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境的加載方法 利用對(duì)細(xì)胞粘附的基底材料進(jìn)行間接加載, 通過對(duì)基底材料加載后使基底材料的應(yīng)變傳遞到細(xì)胞上, 如四點(diǎn)彎曲梁的單向應(yīng)變加載和膜材料的雙向應(yīng)變加載方法、氣體加壓加載技術(shù), 以及三維加載技術(shù)等. a.簡(jiǎn)單延長(zhǎng)b.單純軸拉伸c.雙軸拉伸d.四點(diǎn)彎曲梁利用靜水壓使膜拉伸通過氣體流入使膜拉伸機(jī)械力使膜拉伸petriperm 彈力膜培養(yǎng)皿 90 年代初問世。其原理就是通過彈性底面的形變, 使附著于該底面的細(xì)胞受到牽張力。實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)彈性底面圓心的垂直形變量, 達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞受力的目的。另外附加一些機(jī)

4、械裝置, 可以調(diào)節(jié)力的周期。 優(yōu)點(diǎn)：加力方式較為接近正畸臨床牙齒受力狀態(tài),；避免空氣液體傳導(dǎo)靜壓力加力裝置對(duì)實(shí)驗(yàn)周期的限制；可用于體外細(xì)胞培養(yǎng)的持續(xù)性、間歇性間歇性牽張力。 價(jià)格十分昂貴。1.培養(yǎng)液 2.細(xì)胞 3.無底培養(yǎng)皿 4.壓力 5.基座 6.水 7.出水口 8.進(jìn)水口 9.培養(yǎng)膜 細(xì)胞化學(xué)方法染色細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶為陽性, 膜上顯示藍(lán)紫色顆粒, 表明體外培養(yǎng)細(xì)胞能在膜上生長(zhǎng);選用聚醚砜濾膜, 價(jià)格低廉, 為多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)提供了可能, 加力以后可以在其上進(jìn)行細(xì)胞染色、原位雜交、免疫組化染色等技術(shù)。流體剪切應(yīng)力加載裝置平行平板流動(dòng)室錐板流動(dòng)室高度寬度與長(zhǎng)度利用流入管與流出管壓力差使細(xì)胞受到

5、均勻或脈沖的剪切力。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞在受力時(shí)仍保持與基底的粘附缺點(diǎn)：利用培養(yǎng)液流動(dòng)產(chǎn)生力的作用，生化成分檢測(cè)困難透明錐板與平板以相同速度反向運(yùn)轉(zhuǎn)，獲得穩(wěn)定層流，使其間的細(xì)胞受到穩(wěn)定、均勻、較大范圍的剪切力。復(fù)雜流體剪切應(yīng)力裝置 模擬體外力學(xué)環(huán)境的加載方法 離心力加載裝置 空氣液體傳導(dǎo)靜壓力加載裝置離心力加載裝置原理：經(jīng)分離培養(yǎng)得到的離體細(xì)胞在離心力作用下受到離心力、重力、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的摩擦力。用于觀察失重狀態(tài)下細(xì)胞變化,對(duì)重力生理學(xué)和航天生物學(xué)具有獨(dú)立的理論、實(shí)際意義。缺點(diǎn)：細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間無附著關(guān)系，從而影響細(xì)胞的功能狀態(tài)，無法反映真實(shí)的細(xì)胞生理狀態(tài)?？諝庖后w傳導(dǎo)靜壓力加載裝置氣體密閉室流

6、體密閉室可以研究液壓對(duì)細(xì)胞周期、骨架微絲微觀形態(tài)的影響。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、易于傳遞載荷、細(xì)胞受載均勻缺點(diǎn)：環(huán)境密閉，培養(yǎng)條件不易維持，不利于長(zhǎng)時(shí)間觀察研究單細(xì)胞力學(xué)特性的加載方法微管吸吮技術(shù)發(fā)展：20世紀(jì)30年代,cole采用擠壓的方法研究海膽卵的彈性構(gòu)造； 照片上不能準(zhǔn)確地確定接觸面積; norris細(xì)各一微形針置于紅細(xì)胞中,測(cè)量針的彎曲變形確定作用力；這一方法難以實(shí)現(xiàn)； 50年代中期,微管吸吮技術(shù)出現(xiàn)。 采用顯微技術(shù)和微管吸吮方法直接對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行加載, 通過實(shí)時(shí)記錄系統(tǒng)記錄, 利用圖像處理儀和計(jì)算機(jī)進(jìn)行位移測(cè)量及變形數(shù)值分析。應(yīng)用：檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞對(duì)變形和粘附的重要手段。 微管

7、吸吮技術(shù)組成：由微吸管、顯微操作器、倒置顯微鏡、負(fù)壓加載系統(tǒng)、磁帶實(shí)時(shí)記錄系統(tǒng)、圖像處理儀、計(jì)算機(jī)等組成優(yōu)點(diǎn)：測(cè)量精細(xì)，易于標(biāo)定；重復(fù)性好缺點(diǎn)：檢測(cè)對(duì)象為單個(gè)細(xì)胞；變形部分膜張力不均；技術(shù)方面的校正技術(shù)遵循基本假定:細(xì)胞膜與玻璃管之間沒有磨擦力(通常管的表面涂有一層蛋白質(zhì));動(dòng)態(tài)條件下,培養(yǎng)液流體粘性力相對(duì)于細(xì)胞自身的粘性力是可以忽略的。分子水平加載技術(shù)原理：通過對(duì)細(xì)胞表面受體施加磁場(chǎng)扭曲力的方法,測(cè)量細(xì)胞骨架剛度的變化。過程：微米級(jí)的永久性磁球,表面結(jié)合蛋白質(zhì)分子使磁球與細(xì)胞膜受體結(jié)合;外加磁場(chǎng)磁化磁球,在垂直方向加一個(gè)均勻弱磁場(chǎng)使磁球旋轉(zhuǎn);此時(shí)如果受體與細(xì)胞骨架連接在一起,細(xì)胞骨架對(duì)磁球的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生阻力。測(cè)量：測(cè)量磁球產(chǎn)生的磁場(chǎng)力的變化,定量地獲得細(xì)胞內(nèi)的力學(xué)參數(shù)。外力矩和應(yīng)力可以用標(biāo)準(zhǔn)粘性物質(zhì)標(biāo)定,磁球旋轉(zhuǎn)的角度可以用磁力測(cè)量?jī)x測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：施力恒定，受力均勻，磁力定量，方便定位；可以測(cè)量細(xì)胞受體分子水平的力學(xué)性質(zhì)。從外界力到功能 應(yīng)力/應(yīng)變影響細(xì)胞的形態(tài),到達(dá)感應(yīng)細(xì)胞的感受器； 獲知到應(yīng)力刺激后，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)； 傳導(dǎo)到達(dá)效應(yīng)位點(diǎn)，調(diào)節(jié)相關(guān)分子的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的功能活動(dòng)。展望 不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性較差. 與細(xì)胞本身力學(xué)性能的復(fù)雜性相關(guān)外, 還有實(shí)驗(yàn)手段、方法、原理的限制。 開發(fā)模擬紊流和過渡流的