循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC檢測及臨床應(yīng)用

1、武漢友芝友生物制藥有限公司循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及臨床應(yīng)用中文摘要：循環(huán)腫瘤細(xì)胞是從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散，進(jìn)入到血液或淋巴系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中含量稀少，一般先將循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集，然后再進(jìn)行檢測，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了多種細(xì)胞富集和檢測技術(shù)。本文主要對CTCs的富集和檢測技術(shù)研究進(jìn)展，以及CTCs在臨床分析和研究上的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細(xì)胞 富集 檢測 臨床 Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into the

2、 blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and dete

3、ction techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research.Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical 癌癥轉(zhuǎn)移的過程是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)從原發(fā)腫瘤分離，通過循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散，進(jìn)入血液或者淋巴系統(tǒng)，在遠(yuǎn)處形成新的腫瘤，最終導(dǎo)致大多數(shù)的癌癥病人死亡1。1869年，Ashworth在一例癌癥死亡患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤的細(xì)胞，并首

4、次提出了CTCs的概念2。從此，越來越多的研究表明，CTCs的出現(xiàn)與癌癥密切相關(guān)。通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，實(shí)體瘤的上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞的變化，使他們通過增加流動性和侵襲性脫離組織，進(jìn)入到血液中，附著，、發(fā)展成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移3。由于CTCs能夠代表原發(fā)腫瘤的表型和遺傳組成，并能夠作為任何轉(zhuǎn)移性腫瘤的”液體活檢”，CTCs的富集分離和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和計(jì)數(shù)技術(shù)已經(jīng)建立，其中CTCs的計(jì)數(shù)可以成為預(yù)測指標(biāo)，當(dāng)其大于已知的閾值時，就預(yù)示著病人就患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌4，、前列腺癌5，、結(jié)直腸癌等6?；谂R床試驗(yàn)，美國FDA批準(zhǔn)了一種臨床檢測CTCs的Cell Search技術(shù)，用于上述癌

5、癥的CTCs的富集和計(jì)數(shù)。Cell Search技術(shù)成功的證明了CTCs確實(shí)表征了疾病的活躍，CTCs數(shù)量的增加預(yù)示著病情的惡化，可以通過CTCs了解原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，以CTCs為基礎(chǔ)的分析，可以幫助人們實(shí)時診斷和預(yù)測，對病情做出決定，并取樣檢測耐藥性。大多數(shù)常規(guī)的癌癥治療方法在治療轉(zhuǎn)移性癌癥方面難以成功，CTCs的可能促進(jìn)腫瘤的臨床研究。CTCs在血液中極其稀少，數(shù)十億的外周血細(xì)胞也阻礙了對CTCs的分離和分子鑒定?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了大量的技術(shù)用于富集和檢測CTCs，其中有些已經(jīng)成功的用于測試或者臨床評估。本文主要綜述CTCs的富集和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，以及對CTCs的在臨床分析和研究上應(yīng)用。

6、1 CTCs富集技術(shù)為了從大量血液細(xì)胞中捕獲數(shù)量稀少的CTCs，富集分離技術(shù)必須足夠敏感性，可重復(fù)性，可靠，、快速，、便宜，并且所需獲取血液量要盡量少，方便實(shí)現(xiàn)過程自動化，方便下游分析。此外，富集分離的CTCs要能夠保持他們的活性，在富集分離的過程受到的干擾要盡量小，因?yàn)檫@可能改變CTCs的狀態(tài)和表型7。CTCs富集的技術(shù)有很多種，這些技術(shù)使用多個性能參數(shù)評估(即捕獲效率，純度，細(xì)胞活力，富集速度，血液樣本容量等)，然后通過檢測臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。最佳的富集分離方法可能需要之間的性能參數(shù)的折衷，而且可能依賴于下游的應(yīng)用。CTCs的富集技術(shù)主要根據(jù)免疫親和性，物理性質(zhì)和直接分析分為三類。1.1 免

7、疫親和性(Immunoaffinity)以免疫親和性為基礎(chǔ)的CTCs富集主要是利用捕獲抗體(如EpCAM抗體)和CTCs靶抗原(如EpCAM)之間的高度特異性?；贓pCAM抗體的富集技術(shù)有很多種，主要區(qū)別在于捕獲的方法有所不同?？贵w捕獲的方法主要有以下幾種。1.1.1免疫磁珠法(Magnetic beads)免疫磁珠法富集CTCs主要是利用捕獲抗體(如EpCAM抗體)和CTCs抗原(如EpCAM)之間的高度特異性反應(yīng)，免疫作用促使抗原與耦合到磁珠的抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，然后抗原-抗體復(fù)合物被置于磁場作用之下，通過磁場對磁珠固定從而使CTCs與其他血液細(xì)胞分離，產(chǎn)生富集效果。Cell Sear

8、ch系統(tǒng)是免疫磁珠方法應(yīng)用的典型代表。在該方法中，經(jīng)過密度梯度離心富集的外周血被收集到含有防凝劑的收集管中，然后被放置到一個自動化的制備系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用免疫磁珠富集EpCAM陽性的細(xì)胞。捕獲效率主要與EpCAM的表達(dá)水平有關(guān)。有研究表明在EpCAM高表達(dá)的細(xì)胞中，有大約75%的捕獲效率，而在EpCAM低表達(dá)的細(xì)胞中，大概只有42%的表達(dá)捕獲效率。在檢測的過程中，富集的細(xì)胞與CD45，CK的抗體孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分別用PE和APC熒光標(biāo)記，然后，EpCAM陽性的CTCs被anti-ck-PE抗體標(biāo)記，而白細(xì)胞被anti-CD45-APC抗體標(biāo)記。標(biāo)記的細(xì)胞被CellTrac

9、k Analyzer 計(jì)數(shù)和分析，最終，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白細(xì)胞是CK-/DAPI+/CD45+。系統(tǒng)的這種半自動特征使得樣本的檢測非常迅速，而且具有很好的重復(fù)性8。磁鐵清掃裝置(magnetic sweeper device)是新開發(fā)出來的技術(shù)，磁鐵清掃裝置提高被磁珠包被的EpCAM抗體的捕獲能力。這種技術(shù)的可以達(dá)到62%的捕獲效率，51%的純度，9ml/L的通量9。用這種磁珠清掃設(shè)備用RT-PCR的方法從30個轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人中的21個病人的血液中檢測出了CTCs10。磁性篩裝置(magnetic sifter device)，通過微陣列的形式在磁場孔邊緣產(chǎn)生極高

10、的磁性區(qū)域，在富集過程中使用垂直流動構(gòu)造，可以增強(qiáng)捕獲效率到91.4%，提高了處理速度，最優(yōu)達(dá)到10ml/h11。AdnaTest(Adnagen AG， Langenhagen， Germany)是一個商業(yè)化的設(shè)備，它采用了磁珠與各種癌癥(如乳腺癌，直結(jié)腸癌，前列腺癌，卵巢癌)的特異性抗體進(jìn)行雞尾酒式結(jié)合，并用多重RT-PCR的方式檢測CTCs，這套實(shí)驗(yàn)裝置已經(jīng)真是可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，卵巢癌。比較研究發(fā)現(xiàn)，Adna Test breast cancer裝置從55個轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人中的29個病人血液中檢測出了CTCs，而Cell Search裝置只從26個檢測出了CTCs12。Fig 1 Ce

11、ll Search富集檢測CTCs流程1.1.2CTC-chipCTC-chip是一種基于免疫親和以及芯片的CTCs檢測技術(shù)，在970mm2的表面上，排列了78000個被EpCAM抗體包被的硅微柱，用于捕獲CTCs。通過抽氣產(chǎn)生壓力使血液樣品以1-2ml/h的速度不間斷的從芯片表面通過。這種緩慢的流速可以保證CTCs吸附在EpCAM包被的微處理器上。而這種硅微柱提供了大量的表面積用于接觸，從而使EpCAM表達(dá)高或者低的CTCs的捕獲效率差別不大，捕獲效率超過60%，純度大約50%。用癌癥患者和健康人體的血液樣品經(jīng)過CTCs-chip檢測，從116個患者中的115個患者身上檢測到了CTCs，而2

12、0個健康人體沒有檢測到CTCs，敏感性達(dá)到了99.1%，特異性為100%。同時，檢測到的CTCs數(shù)目與病人的病情相關(guān)13。一種類似的微柱是在”geometrically enhanced differential immunocapture”微芯片上連接前列腺特異性膜抗原(PSMA)，這種微芯片的捕獲效率為85%，純度為68%，并且從20個前列腺病人中的18個檢測到了CTCs14。最近，Ozkumur等開發(fā)了”CTC-iChip”，該裝置可以用于以陽性EpCAM抗體的CTCs篩選，也可以用于以大小為基礎(chǔ)的富集步驟后對白細(xì)胞的消除。據(jù)報(bào)道，他們的捕獲效率達(dá)到了98.6%，純度為0.02-42%。

13、CONG 42個轉(zhuǎn)移性癌癥病人中的37個身上檢測出了CTCs，而Cell Research僅從29個病人身上檢測到CTCs15。Fig 2 CTC-chip 富集檢測CTCs流程1.1.3納米結(jié)構(gòu)底物(Nanostructured substrate)Wang等利用納米結(jié)構(gòu)底物，以非常高的接觸比表面積進(jìn)行免疫親和，用EpCAM抗體結(jié)合納米柱，獲得捕獲效率95%，通量為1ml/h。用這個方法從26個前列腺癌中的20個病人身上檢測到了CTCs16。該芯片又被進(jìn)一步修飾為以靜電聚合物納米纖維為底物，并與激光捕獲顯微切割聯(lián)用，分離單個前列腺癌癥CTCs，然后可用于擴(kuò)增或全基因組測序17。Fig 3 納

14、米結(jié)構(gòu)底物富集CTCs流程1.1.4微纖維(Microtubes)Hughes等用仿生的方法模擬血管選擇素接到的細(xì)胞粘附過程進(jìn)行CTCs捕獲。選擇素包被的圍觀外觀？誘導(dǎo)細(xì)胞附著和卷曲，促進(jìn)CTCs與抗EpVAMEpCAM抗體和PSMA抗體，在4.8ml/h，這個裝置的捕獲效率為50%，純度為66%，并且從14個測試病人的血樣中全部能夠檢測到CTCs，而Cell Search中質(zhì)中只檢測到9個18。1.1.5 體內(nèi)采樣(In vivo sampling)Saucedo-Zeni等開發(fā)了一種體內(nèi)采樣的方法，將醫(yī)學(xué)導(dǎo)線與EpCAM抗體連接，醫(yī)療導(dǎo)線通過插管注射到患者靜脈30分鐘，以潤徐允許大體積的血

15、液(1.5-3L)直接連續(xù)采樣。這個方法成功的在24個乳腺癌或者肺癌病人中的22個病人身上腹肌富集到了CTCs19。1.1.6白細(xì)胞消除(Leukocyte depletion)使用白細(xì)胞抗原(如CD45，CD14等)的單克隆抗體，以減少造血起源的細(xì)胞。一些策略包括抗體標(biāo)記白細(xì)胞標(biāo)記，通過免疫磁珠分離去除白細(xì)胞，這些方法都能夠有很好的恢復(fù)率和對CTCs的最小干擾，但可能降低樣品的純度20。1.1.7 小結(jié)抗原-抗體反應(yīng)的特異性是使CTCs的分離具有非常高水平的特異性。然而，CTCs的富集結(jié)果將嚴(yán)重依賴于所實(shí)用使用的特定抗體的性能。目前還有沒已知的理想CTCs抗原靶，點(diǎn)可已可以將所有的CTCs捕

16、獲而對所有的造血細(xì)胞排斥。最近的報(bào)告表明，抗EpCAM的方法可能錯過不表現(xiàn)上皮表型的CTCs，這可能由于EMT和EpCAM在一些上皮細(xì)胞CTCs的可變表達(dá)21。使用雞尾酒式的抗體組合，可能會增加捕獲效率，但也可能會降低特異性和樣品的純度。白細(xì)胞消除方法的好處是在分離過程中不會干擾CTCs的表型，但也可能會使附著在白細(xì)胞或者與白細(xì)胞相互作用的CTCs丟失。白細(xì)胞消除法會導(dǎo)致CTCs的純度比陽性免疫親和方法獲得的CTCs純度降低。一般來講，免疫親和方法需要長時間的孵育和反應(yīng)時間，來富集更多地CTCs，這也可能成為加快速度的瓶頸。對于用陽性篩選的免疫親和方法而言，將CTCs從免疫親和標(biāo)簽上分開也可能

17、是個挑戰(zhàn)。1.2 物理特征物理特征也可用于有效的地將CTCs從外周血中分離出來。以下的一些技術(shù)主要是利用CTCs與其他細(xì)胞在密度，、大小，、變形性和電離特征等方面的差異進(jìn)行分離的。1.2.1 密度梯度離心(Density gradient centrifugation)密度梯度離心是一種分離CTCs的低成本有效的方式，依據(jù)密度的不同可以把單核細(xì)胞從血液中的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞中分離出來。Weitz等使用聚蔗糖溶液的密度梯度離心來分離CTCs，用RT-PCR方法檢測CK20的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在1ml血液中有1個CTCs，并且在58個結(jié)直腸癌患者中的24個患者血液中檢測出了CTCs22。OncoQuick是一

18、種將密度梯度離心和按大小分離結(jié)合的一種技術(shù)。Muller等使用OncoQuick從5/60的原發(fā)性乳腺癌患者血液中，25/63的乳腺癌患者中檢測到了CTCs23。1.2.2 微孔過濾(Microfiltration)微孔過濾的原理是，讓小的紅細(xì)胞白細(xì)胞通過微孔，而稍大的CTCs被阻擋不能通過。Vona等開發(fā)了ISET技術(shù)，該技術(shù)使用了中間有8m直徑的圓孔的隨機(jī)徑跡蝕刻聚碳酸酯過濾膜，用于CTCs的富集和細(xì)胞檢測。這種有微孔的濾膜比Cell Search設(shè)備更加敏感，使用微孔過濾從57/60轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人身上檢測到了CTCs，而使用Cell Search只從42/60的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人身上檢測

19、到了CTCs24。zheng等改進(jìn)了這種微孔濾膜，他使用對二甲苯聚合物制成了圓形或橢圓的微孔濾膜使捕獲效率提高到了89%25。這種對聚二甲苯濾膜從51/57的癌癥患者身上檢測到CTCs，而用CellSearch技術(shù)只從26/57的癌癥換證身上檢測到CTCs。Zheng等接著研發(fā)了3D的微孔濾膜，包含了兩層的聚對二甲苯，同時在頂部和底部層具有微制造限定的孔，這兩個層之間的空隙，通過光刻精確限定。這個裝置的而重要特征就是，底部膜的孔位置從頂膜孔的位置偏移，如果腫瘤細(xì)胞被截留在頂部膜的孔，底部的膜可以提供直接反作用力，減少張力對CTCs細(xì)胞膜的作用，張力的減少適用于細(xì)胞進(jìn)入孔的動態(tài)過程。每個濾膜片具

20、有上面36個9m直徑的孔，底部37個8m直徑的孔。它還通過在頂部和底部膜形成的間隙允許更小的細(xì)胞通過的同時阻斷大細(xì)胞，這樣可以有效的充當(dāng)過濾過程中的第三臨界尺寸，確保對CTCs富集的高效率高純度26。Fig 4 3D Microfiltration技術(shù)富集CTCs示意圖1.2.3 微流體(microfluidics) 微流體裝置是以大小和變形性為基礎(chǔ)的富集CTCs的方法。Tan等設(shè)計(jì)了有5微米縫隙寬度的月牙形陷阱陣列，從血液中富集CTCs，捕獲效率和純度都達(dá)到了80%以上。這種微型裝置成功的從轉(zhuǎn)移性肺癌患者的1-3ml的血液中檢測到了CTCs27。更高通量的微流體運(yùn)用慣性流分離的水動力去選擇不

21、同大小的細(xì)胞，原理是通過制定收縮和膨脹的微水池檢測CTCs。這些裝置極大地提高了通量，并且能夠處理較大體積的樣品，但也可能降低白細(xì)胞中的CTCs的富集和回收效率28。Sun等開發(fā)了雙螺旋微流體通道流體動力學(xué)使用拖拽力分離CTCs，能從稀釋的血液中富集到88.5%的CTCs29。1.2.4電場流分離(Dielectrophoresis)CTCs的帶電特性可被利用來從血液中分離，通過電泳現(xiàn)象施加一個非均勻電場。Becker等利用叉指金電極分離白血病和乳腺癌細(xì)胞。由電極產(chǎn)生的電場由陽極吸引腫瘤細(xì)胞，而其他細(xì)胞會流過。除去電廠電場的腫瘤細(xì)胞可以被富集，捕獲效率可以達(dá)到95%30。Gupta等開發(fā)了Ap

22、oStream儀器，從血液中捕獲CTCs的效率大于70%31。Fig 5 ApoStream 富集CTCs流程示意圖1.2.5 小結(jié)利用物理特征分離CTCs的方法簡單易行，并且不受CTCs表面抗原表達(dá)的影響。因此，他們不容易被抗原表達(dá)的變化或者由于EMT導(dǎo)致的表面生物標(biāo)志的缺失影響，并且捕獲效率常常大于80%。密度梯度離心是一個強(qiáng)大的技術(shù)，作為富集的第一步非常有效。白細(xì)胞消除分離是一種很有前途又較為侵入性的方法，允許更多地血液采樣，提高患者的檢測靈敏度。密度梯度離心法的CTCs純度不足，需要進(jìn)一步的富集純化，否則會影響下游的繼續(xù)分析。微孔過濾法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的富集，能夠在幾分鐘內(nèi)處理滿管的血液

23、。但是CTCs與大的白細(xì)胞之間存在大小分布重疊，是富集分離樣品的純度低于10%，此外，較小的CTCs或CTCs片段可能會漏掉。改進(jìn)的微流體方法是獲得CTCs的純度超過80%，但同時也會是通量降低到1ml/h。用水力驅(qū)動的微流體管可能能夠?qū)崿F(xiàn)高通量，但同時也會降低捕獲效率或純度。應(yīng)用電泳的DEP技術(shù)是一種比較新穎的技術(shù)，獲取的CTCs活力很強(qiáng)，也不會影響對CTCs的捕獲。但DEP技術(shù)還沒有在臨床上進(jìn)行徹底的評估，因此其臨床利用價(jià)值還需要進(jìn)一步的評估。1.3 直接分析另一種分離稀少的CTCs的方法是對血液中的全部細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高通量的分析。1.3.1 光纖陣列掃描(Fiber-optic array s

24、canning)Krivacic等開發(fā)了一種高通量的“光纖陣列掃描技術(shù)”，能夠每秒分析300000個細(xì)胞32。血液首先處理使紅細(xì)胞裂解，然后將所有剩下的細(xì)胞鋪在載玻片上。紅細(xì)胞裂解主要是使用紅細(xì)胞裂解緩沖液(ELB)，主要成為有NH4Cl，KHCO3和EDTA等。光纖陣列掃描技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)能夠有效地計(jì)數(shù)乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌和卵巢癌的CTCs。1.3.2 微霍爾效應(yīng)傳感器(Micro-Hall sensor)Issadore等應(yīng)用微霍爾效應(yīng)傳感器檢測CTCs，通量可以達(dá)到大約每分鐘107個細(xì)胞。CTCs可以納米磁珠標(biāo)記連接各種感興趣的抗體(如EpCAM，HER2，EGFR，MUC1)，

25、接著從有傳感器陣列的表面流過，傳感器陣列可以測量由每一個標(biāo)記細(xì)胞的磁流誘導(dǎo)產(chǎn)生的霍爾電壓。這種技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)比Cell Search系統(tǒng)的敏感性更好33。1.3.3 小結(jié)通過直接分析檢測CTCs只需要對紅細(xì)胞裂解，不需要對血液中的CTCs進(jìn)行富集，減少了富集中的細(xì)胞損失。光纖掃描可以通過高質(zhì)量圖像和光學(xué)分析對CTCs進(jìn)行有效檢測。簡單的芯片上的利用霍爾效應(yīng)的電子檢測并不需要光學(xué)儀器，因此具有便攜性和個人護(hù)理的巨大潛力，不過該方法僅僅只能用于對CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)。2 CTCs檢測經(jīng)過富集分離的CTCs還需要進(jìn)一步的檢測，常用的檢測方法主要分為免疫檢測和分子檢測兩種。2.1免疫檢測 2.1.1免疫組

26、織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry)免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用顯色劑標(biāo)記的單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞上的抗原結(jié)合并使其顯色， 進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定位定量定性分析。Sloane等1980年首次采用ICC方法檢測乳腺癌患者骨髓中瘤細(xì)胞34。上述CellSearch系統(tǒng)和CTCs-chip富集CTCs后的檢測即為免疫組織化學(xué)檢測。其過程為富集的細(xì)胞與CD45，CK的抗體孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分別用PE和APC熒光標(biāo)記，然后，EpCAM陽性的CTCs被anti-ck-PE抗體標(biāo)記，而白細(xì)胞被anti-CD45-APC抗體標(biāo)記。最終，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而

27、白細(xì)胞是CK-/DAPI+/CD45+。盡管一些用于CTCs捕獲的抗體也能用于不同的癌癥類型的免疫檢測，如EpCAM用于乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌和其他的表皮腫瘤，癌癥特異性的抗體也可能會適用，如PSMA或PSA用于前列腺癌檢測。免疫組織化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，直觀，腫瘤細(xì)胞未被破壞，可以進(jìn)行后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒別或核酸特征分析。 2.1.2 上皮細(xì)胞免疫斑點(diǎn)技術(shù)(Epithelial immunospot，EPISPOT)EPISPOT是一種基于抗體的方法對活的CTCs進(jìn)行量化檢測。其基本流程是，富集的CTCs在培養(yǎng)基中能夠分泌特異性蛋白，使用熒光標(biāo)記的分泌蛋白抗體，與CTCs孵育，使抗體與蛋白特異性結(jié)合

28、，然后將孵育的液體平鋪在載玻片上，通過熒光顯微鏡觀察，每個斑點(diǎn)就代表一個CTCs35。Alix-Panabières C等通過免疫磁珠去除CD45+細(xì)胞，再通過CXCR4+細(xì)胞富集CTCs后，用EPISPOT檢測乳腺癌CTCs 釋放的特異蛋白質(zhì)，如cathepsin-D(半胱氨酸蛋白酶)和Mucin-1，檢測到的CTCs具有轉(zhuǎn)移潛能。EPISPOT以Mucin-1和CK19作標(biāo)志物檢測乳腺癌CTCs，表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性36。Fig4 EPISPOT 檢測CTCs流程示意圖2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)流式細(xì)胞技術(shù)是在CTCs經(jīng)過富集后，運(yùn)用標(biāo)記熒光物質(zhì)

29、的單克隆抗體與CTCs特異性的標(biāo)志物結(jié)合，使CTCs染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測量分析。流失細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要是可以再免疫放大檢測CTC的s同時對CTCS的形態(tài)進(jìn)行定量測定，而且測量速度迅速，檢測數(shù)據(jù)較精確。流式細(xì)胞技術(shù)還可以進(jìn)行多參數(shù)測量，并對細(xì)胞進(jìn)行分析與分選。最近幾年已經(jīng)有多種改進(jìn)的流式細(xì)胞儀用于CTCs測定，例如光聲流式細(xì)胞儀37，光熱流式細(xì)胞儀38，多色流式細(xì)胞儀39，光纖多光子流式細(xì)胞儀40，多參數(shù)流式細(xì)胞儀41。Watanabe等研制了一種以流式細(xì)胞儀為基礎(chǔ)的細(xì)胞捕獲平臺，利用On-chip技術(shù)，組成了一種新穎的配備了一次性微流控芯片的流式細(xì)胞儀，能夠?qū)ρ褐械难h(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢

30、測，捕獲和分子特性分析42。2.2分子檢測RT-PCR是CTCs分子檢測中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。RT-PCR檢測CTCs是基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后DNA水平的異常， 這些mRNA不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞， 所以在外周血中檢測到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。為了提高準(zhǔn)確度，一般會同時檢測幾個標(biāo)志物。這種技術(shù)的敏感性能夠達(dá)到1-10個CTCs/ml血液，相當(dāng)于從每106-107個外周血細(xì)胞有1-10CTCs即可被檢測出來42。在目標(biāo)基因被RT-PCR擴(kuò)增以后，可以通過凝膠電泳和southern雜交進(jìn)行半定量分析，樣品也可以與健康對照衡量目的基因的表達(dá)水平，建立臨界值。

31、另外ELISA法也可以與RT-PCR聯(lián)用，與凝膠電泳相比，可以提高檢測的靈敏度，并且PCR 產(chǎn)物可以半定量光學(xué)檢測43。近年來，人們又發(fā)展出巢式PCR，熒光定量RT-PCR等技術(shù)，提高了檢測的敏感度和特異性，而且可以對樣本進(jìn)行定量分析。熒光定量RT-PCR可以對mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。熒光定量RT-PCR也比RT-PCR更加敏感，可以在107-108個單核細(xì)胞中檢測到1個CTCs44。3 CTCs的臨床應(yīng)用分析現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了很多分析方法，分析CTCs的細(xì)胞和分子特征，以開發(fā)CTCs的在臨床療效上的潛在影響。這些分析方法與CTCs的富集技術(shù)相結(jié)合，因?yàn)槊總€下游的應(yīng)用都會對CTCs有自己的要求，

32、比如敏感性，樣品純度，細(xì)胞活力，濃縮后恢復(fù)細(xì)胞的能力。不同的分離技術(shù)可能會更適合下游的特殊應(yīng)用。在醫(yī)療樣品中，通常建立一種新的方法是和CellResearch結(jié)果進(jìn)行比較。3.1免疫表型分析(Immunophenotyping) 免疫組織化學(xué)染色是CTCs檢測和計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，這種標(biāo)準(zhǔn)由FDA批準(zhǔn)的CellSearch系統(tǒng)樹立。這種檢定CTCs的標(biāo)準(zhǔn)包括:(1)CK的陽性表達(dá);(2)白細(xì)胞抗原CD45的陰性表達(dá);(3)細(xì)胞核的陽性染色。癌癥特異性的標(biāo)記也可以用來陽性CTCs鑒定，比如在前列腺癌中使用PSA或者PSMA。CTCs的免疫表型可以直接用于臨床醫(yī)療，直接影響治療選擇。通過檢測CTCs的

33、數(shù)目，可以判斷患者的病情45。3.2 檢測基因拷貝數(shù)變化在很多的癌癥患者的癌癥相關(guān)基因拷貝數(shù)發(fā)生了變化，可以通過FISH的方法來檢測。Meng等利用FISH技術(shù)分析了乳腺癌患者的CTCs的致癌基因HER2的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤和CTCs中，HER2存在一定的非一致性46。用IF技術(shù)和RT-PCR技術(shù)的研究也證實(shí)了這一情況。這表明，一個HER2陰性疾病的癌癥患者經(jīng)過一定的過程后，CTCs可能發(fā)展成HER2陽性。CTCs分析提供了一個通過微創(chuàng)途徑反復(fù)篩選染色體異常的途徑。有趣的是，CTCs的HER2擴(kuò)增的篩選已經(jīng)成功的應(yīng)用于原發(fā)性乳腺癌患者。3.3 檢測致癌基因轉(zhuǎn)移致癌基因的轉(zhuǎn)移也是一種重要的癌

34、癥的致病機(jī)制。TMRPSS2-ERG的轉(zhuǎn)移發(fā)生在30-70%的前列腺癌患者身上。運(yùn)用FISH技術(shù)分析CTCs，在CTCs中檢測出了TMRRSS2-ERG融合47。在最近的研究中，應(yīng)用FISH技術(shù)，在非小細(xì)胞肺癌患者CTCs中檢測到了ALK基因重排48。3.4 致癌基因突變分析富集分離CTCs的一個主要應(yīng)用就是檢測致癌基因的突變。致癌基因的突變，常常用來預(yù)測腫瘤的惡化，疾病的發(fā)病原因，預(yù)測藥物的敏感性。使用微芯片分離的CTCs，運(yùn)用位點(diǎn)特異性的PCR技術(shù)可以有效地檢測到EGFR的突變49。這種EGRF T90M突變賦予的藥物抗性，也在接受EGFR激酶抑制劑的患者身上檢測到了。等位特異性的PCR是

35、一種快速和低成本的方法檢測特定的基因突變。對于致病基因的突變，可以從CTCs的基因組DNA 或者cDNA中擴(kuò)增致病基因，并進(jìn)行測序。Gasch等運(yùn)用全基因組擴(kuò)增和突變特異性PCR方法從結(jié)直腸癌患者的CTCs中檢測到了KRAS和PIK3CA基因的突變50。3.5 基因組分析 現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了單細(xì)胞基因組測序技術(shù)，可以通過對CTCs基因組的測序，與正常細(xì)胞對比，分析CTCs基因組的基因突變，基因缺失，基因拷貝數(shù)變化，基因的轉(zhuǎn)移等。單一的CTCs的測序 可能徹底改變我們隊(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥的認(rèn)識，提高臨床護(hù)理的潛力。3.6 CTCs基因表達(dá)譜分析通過對CTCs表達(dá)譜分析，可以找到CTCs中特異表達(dá)基因，可以進(jìn)

36、一步應(yīng)用于CTCs臨床檢測和癌癥發(fā)病機(jī)理等研究。Smirnov等從一個轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，一個轉(zhuǎn)移性前列腺癌，一個轉(zhuǎn)移性乳腺癌患血液里，富集超過100個CTCs，通過對CTCs富集的樣品RNA和CTCs消除的樣品RNA進(jìn)行表達(dá)譜分析，找到了一系列癌癥特異性基因，CTCs特異性基因，并通過進(jìn)一步的驗(yàn)證，確定AGR2，F(xiàn)ABP1等對于CTCs檢測具有重要作用51。Powell等用生物標(biāo)記數(shù)字PCR(BioMark digital PCR)對免疫富集后的單個CTCs的基因表達(dá)，表達(dá)譜表明，CTCs間存在高度的異質(zhì)性，同時也發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞系之間存在較小的一致性。3.7 RNA測序Yu等用微

37、流體芯片分離了胰腺癌患者的CTCs，然后用RNAseq技術(shù)對單個CTCs進(jìn)行了RNA測序，測序結(jié)果表明，在CTCs中，WNT通路信號激活，而這種信號可能是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的原因52。4 總結(jié)癌癥是世界上三大死亡率最多的疾病之一。CTCs檢測的價(jià)值已經(jīng)在乳腺癌前列腺癌結(jié)直腸癌Error! Reference source not found.中被證實(shí)，除此之外，在肺癌胃癌膀胱癌等腫瘤中CTCs檢測的工作也在開展。Cell Search是目前唯一被FDA批準(zhǔn)商業(yè)應(yīng)用的體外CTCs檢測設(shè)備。經(jīng)過多年的研究發(fā)展，人們逐漸開發(fā)了多種CTCs的富集和檢測技術(shù)，這為研制新的CTCs檢測設(shè)備，更好的研究應(yīng)用CTC

38、s提供了巨大的技術(shù)支持。有了這些技術(shù)積累，在不遠(yuǎn)的將來，必然會有更多的CTCs檢測設(shè)備會研制成功，投入商業(yè)應(yīng)用，從而可以幫助人們更好的進(jìn)行早期臨床診斷，判斷患者預(yù)后評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療。參考文獻(xiàn)1 Hanahan, D,Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell.2011, 144:646674.2 Ashworth, T. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood

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