同源模建的方法與結(jié)果分析

1、同源模建的方法與結(jié)果分析Version 1.0.2-序言：作為一個(gè)以實(shí)驗(yàn)為主的生化工作者來(lái)說(shuō)，很多時(shí)候可以通過(guò)分子生物學(xué)手段獲取自己需要的目的基因，并在各種表達(dá)載體和宿主中進(jìn)行對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)，隨后對(duì)于這些蛋白的特性進(jìn)行研究，這也是一般酶學(xué)研究的特定套路。而近十幾年來(lái)，人們開(kāi)始思考是否能夠?qū)⑻匦耘c蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，從分子水平理解蛋白質(zhì)與底物之間的相互作用呢？于是類(lèi)似于蛋白結(jié)構(gòu)模建、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、量化計(jì)算等多種手段相繼被創(chuàng)造以及應(yīng)用。在這些方法中，同源模建無(wú)疑是最基礎(chǔ)也是最重要的一個(gè)步驟，因?yàn)槠滟|(zhì)量的好壞直接決定了后續(xù)工作是否可信。因此，本文打算就同源模建的基本原理、常用軟件及

2、服務(wù)器以及結(jié)果分析與改進(jìn)提供一些個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，并希望各位朋友能夠給予批評(píng)指正。1. 同源模建的原理及應(yīng)用限制兩點(diǎn)基本原理：1.一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由其氨基酸序列唯一的決定。知道其一級(jí)序列，至少在理論上足以獲取其結(jié)構(gòu)2. 結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中更穩(wěn)定，變化比序列層面的變化要緩慢許多。應(yīng)用限制：模板蛋白和目標(biāo)蛋白的序列一致性需要大于30%，且越大建模準(zhǔn)確性越有保障。了解了基本的原理，我們需要知道在實(shí)際操作中，同源模建都需要怎么樣進(jìn)行。同源模建的過(guò)程從實(shí)踐中可分為以下7個(gè)步驟：1 模板識(shí)別和初始比對(duì)在序列一致性比較高的時(shí)候，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的序列比對(duì)程序如BLAST獲取目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)（將比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)選擇為PDB數(shù)據(jù)庫(kù)）

3、。2 比對(duì)結(jié)果的校正用以上的方法確定一個(gè)或多個(gè)建模模板后，應(yīng)該采用更為精確的方法已取得更優(yōu)的比對(duì)結(jié)果。有時(shí)在序列一致性較低的區(qū)域比對(duì)兩條序列可能會(huì)具有困難，這個(gè)時(shí)候，我們可以采取其他同源蛋白序列一起參與比對(duì)來(lái)找到解決的辦法。3 主鏈生成比對(duì)完成后，就可以開(kāi)始實(shí)際的建模過(guò)程了，相對(duì)與后面幾步來(lái)說(shuō)，主鏈建模時(shí)最沒(méi)有難度的一步了，因?yàn)榇蟛糠周浖际峭ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的拷貝模板蛋白的主鏈坐標(biāo)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的的。4 環(huán)區(qū)建模這一部分主要是目標(biāo)蛋白和模板蛋白的比對(duì)結(jié)果中存在缺口的部分如何處理的問(wèn)題。第一種解決的方式是略去模板蛋白存在的殘基，留下一個(gè)必須補(bǔ)上的缺口。另一種情況是將主鏈截?cái)啵迦肴鄙俚臍埢? 側(cè)鏈建模當(dāng)

4、我們比較結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)中保守殘基的側(cè)鏈構(gòu)象時(shí)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)他們的側(cè)鏈構(gòu)象通常會(huì)比較相似。這就告訴我們?nèi)绻颖Ｊ貧埢膫?cè)鏈構(gòu)象完整的拷貝到模建蛋白上時(shí)，在某些時(shí)候比先拷貝主鏈構(gòu)象之后，再預(yù)測(cè)側(cè)鏈構(gòu)象來(lái)的可靠。但是這一經(jīng)驗(yàn)規(guī)則在實(shí)際運(yùn)用中僅在兩者序列一致性較高，并且保守殘基之間形成接觸的情況下才能實(shí)現(xiàn)。因此，在現(xiàn)有的測(cè)序中，都是構(gòu)造各種可能的構(gòu)象體，并利用基于能量的函數(shù)打分來(lái)實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈構(gòu)象的選擇的。6 模型優(yōu)化模型優(yōu)化其實(shí)是一個(gè)比較復(fù)雜的問(wèn)題，其質(zhì)量依賴(lài)于高精確性的預(yù)測(cè)側(cè)鏈構(gòu)象體，而為了達(dá)到這種目的，我們需要正確的主鏈，這一步驟實(shí)際又依賴(lài)于側(cè)鏈構(gòu)象體正確的堆積。因此，這一優(yōu)化過(guò)程是迭代直至收斂的過(guò)程

5、。需要注意的是，對(duì)于結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化需要十分謹(jǐn)慎。因此偏離正確結(jié)構(gòu)的途徑比指向正確結(jié)構(gòu)的途徑多很多。在優(yōu)化中的每一步可以排除一些大的誤差，但是也會(huì)引入很多小的誤差，這些小的誤差經(jīng)過(guò)多步積累，就有可能使你的結(jié)果更加偏離正確的結(jié)構(gòu)。7 模型驗(yàn)證所有的模型都包含誤差，誤差的多少主要依賴(lài)于兩方面的內(nèi)容：1.序列一致性的高低，越低的話引入誤差的可能性就越大。2. 模板蛋白中的誤差：如果這種誤差是局域性的，尤其是遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的，對(duì)于你最后進(jìn)行分子對(duì)接等研究室?guī)缀鯖](méi)有影響的。如果是蛋白整體的，則需要小心處理。2. 常用軟件、服務(wù)器2.1常用服務(wù)器：SWISS-MODEL: 網(wǎng)址http:/swissmode

6、/SWISS-MODEL可能是目前非專(zhuān)業(yè)人士應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)在線建模服務(wù)器了。其常見(jiàn)的模式可分為：1. Automated mode:自動(dòng)模式，可以稱(chēng)為是最傻瓜的方式了進(jìn)去之后只需要填上你的email以及在底下的框框內(nèi)輸入你所想模建的蛋白序列，再點(diǎn)擊submit modeling request即可，底下還有高級(jí)選項(xiàng)，支持自定義模板蛋白的pdb以及chain，或者自己上傳模板文件，簡(jiǎn)而言之，真是非常易于操作。這種方法適用于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中存在高度同源的蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)的建模(蛋白序列一致性最好大于80%，個(gè)人經(jīng)驗(yàn))2. Alignment mode:比對(duì)模式基本的操作和自動(dòng)模

7、式類(lèi)似，但是其序列提交的時(shí)候可以提交目標(biāo)蛋白與模板蛋白的序列比對(duì)結(jié)果(FASTA,MSF,ClustalW等格式)，如下所示：這種模式比較適合目標(biāo)蛋白與模板蛋白具有較高的相似性，但是利用自動(dòng)模式未必能找到最合適模板的情況，或者使用者有目的的使用特定的模板蛋白(比如具有更為相似的活性位點(diǎn)結(jié)果，而不是更為相似的整體結(jié)構(gòu))3. Project mode:項(xiàng)目模式項(xiàng)目模式主要是針對(duì)于目標(biāo)蛋白和模板蛋白序列的相似性不高，兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似程度難以直接通過(guò)序列比對(duì)獲得，需要人工插入調(diào)節(jié)(借助蛋白結(jié)構(gòu)編輯軟件deepview)，這個(gè)模式能夠交互式的提高前面兩種模式的模型質(zhì)量(通過(guò)將前兩種模式模建出的蛋白進(jìn)行

8、人為調(diào)整)。屬于針對(duì)比較困難(序列一致性較低)的建模的一種有效途徑。 I-TASSAR: /I-TASSER/ (貌似被墻了？)*也可以下載本地安裝包個(gè)人使用評(píng)價(jià)：根據(jù)結(jié)果質(zhì)量檢驗(yàn)，貌似在用過(guò)的自動(dòng)建模的軟件里是結(jié)果最好的了不過(guò)缺點(diǎn)是給結(jié)果時(shí)間比較長(zhǎng)。 HOMER: http:/protein.cribi.unipd.it/homer/個(gè)人使用評(píng)價(jià)：這個(gè)軟件需要序列蛋白與模板蛋白的結(jié)構(gòu)比對(duì)文件上傳(FASTA格式)，可對(duì)模建的蛋白進(jìn)行l(wèi)oop區(qū)優(yōu)化以及側(cè)鏈優(yōu)化。尚未深入的研究 CPHmodels 3.2 Server： http

9、:/www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/個(gè)人使用評(píng)價(jià)：貌似沒(méi)有任何特色，只需要一條蛋白序列既可以完成自動(dòng)建模。2.2 常用軟件： Modeller:說(shuō)到同源模建，不得不提其中大名鼎鼎的modeller, 要是做同源模建的娃們沒(méi)有聽(tīng)過(guò)modeller, 實(shí)在是不好意思說(shuō)自己玩轉(zhuǎn)了同源模建的。哈哈該軟件由Sali lab開(kāi)發(fā)，目前最新的版本是9.11，可在win下和linux運(yùn)行，需要對(duì)應(yīng)版本的python （<3.0）。該軟件好在什么地方呢？主要是可以自己控制的地方特別多，但這個(gè)也給新手帶來(lái)了不少困擾，比如究竟在特定的場(chǎng)合用什么參數(shù)等等。(本人將在自己以后的

10、學(xué)習(xí)過(guò)程中繼續(xù)分享對(duì)這個(gè)軟件的學(xué)習(xí)心得，真的是挺有意思的)可實(shí)現(xiàn)的功能包括：多聚體建模，二硫鍵建模，雜原子建模(配體、輔酶等)。具體的運(yùn)算流程稍后補(bǔ)充：其最成熟的GUI為 easymodeller，最新版本為4.0。使用方法稍后補(bǔ)充。3. 同源模建結(jié)果評(píng)價(jià)與改進(jìn)策略在我們通過(guò)各種軟件構(gòu)建出一個(gè)蛋白的同源模型后，我們?nèi)绾卧u(píng)價(jià)這一模型是否準(zhǔn)確？如果不準(zhǔn)確如何進(jìn)行進(jìn)一步的修飾能使其更好的應(yīng)用于我們的后續(xù)模擬中呢？這些問(wèn)題將在本節(jié)得以討論3.1 同源模建結(jié)果的評(píng)價(jià)本人最常使用的結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法來(lái)源于UCLA-DOE的SAVES服務(wù)器，其網(wǎng)址為：/SAV

11、ES/提供的檢測(cè)工具包括5種方法：PROCHECK: 該程序可以給出特定蛋白質(zhì)模型的一系列立體化學(xué)參數(shù)，并且能以直觀的彩圖輸出部分結(jié)果。該方法的原理主要是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中高分辨的蛋白晶體結(jié)構(gòu)的參數(shù)進(jìn)行整理，作為標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。將輸入蛋白結(jié)構(gòu)所具有的參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，如果兩者差異顯著，則說(shuō)明輸入的蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯問(wèn)題。其輸出的結(jié)果包括：拉氏圖，主鏈的鍵長(zhǎng)與鍵角，二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，平面?zhèn)孺溑c水平面之間的背離程度等。WHATCHECK:包含大量的檢測(cè)項(xiàng)，可以針對(duì)給定的蛋白結(jié)構(gòu)與正常結(jié)構(gòu)之間的差異，產(chǎn)生一個(gè)非常長(zhǎng)而且詳細(xì)的報(bào)告。ERRAT: 計(jì)算0.35 nm范圍之內(nèi)，不同原子類(lèi)型對(duì)之間形成的非鍵相互作

12、用的數(shù)目。原子按照C、N、O/S進(jìn)行分類(lèi)，所以有六種不同的相互作用類(lèi)型：CC、CN、CO、 NN、 NO、 OO。如果這些相互作用類(lèi)型出現(xiàn)的頻率與正常值相比有較大的區(qū)別，蛋白質(zhì)模型的質(zhì)量就值得懷疑了通常使用9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的滑行窗口用于獲得每一個(gè)窗口的相互作用頻率。類(lèi)似的分析方法可以用于定位局部有問(wèn)題的區(qū)域。Verify_3D: PROVE: 該程序可以比較給定結(jié)構(gòu)的原子體積與預(yù)先計(jì)算好的一系列標(biāo)準(zhǔn)體積之間的差別。體積的計(jì)算方法采用Voronoi polyhedra幾何模型，通過(guò)在原子及其鄰近原子間放置一個(gè)個(gè)分散的平面來(lái)定義每一個(gè)原子占據(jù)的空間。以下以我研究的一個(gè)酶C-C鍵水解酶BphD的模型進(jìn)

13、行實(shí)例講解：背景：首先利用BLAST進(jìn)行蛋白一致性搜索，找出最合適的蛋白模板，經(jīng)確定為2OG1，以此蛋白結(jié)構(gòu)為模板，利用modeller進(jìn)行模建，得到我們的BphD的初始結(jié)構(gòu)，提交到SAVES服務(wù)器進(jìn)行處理：1. PROCHECK結(jié)果：本部分主要需要的是拉氏圖，在第一行中可以點(diǎn)擊ps格式、PDF格式以及JPG格式進(jìn)行下載，我下載了個(gè)PDF文件，大家可以看看下面的截圖：這個(gè)服務(wù)器最好的一點(diǎn)就是可以提供處于各個(gè)區(qū)域的氨基酸殘基占總數(shù)的百分比。拉氏圖的結(jié)果主要分成4個(gè)區(qū)域：核心區(qū)域，允許區(qū)，大致允許區(qū)以及禁阻區(qū)。從圖中可以看到大部分的氨基酸殘基均位于核心區(qū)域 (95.9%),落在允許區(qū)和大致允許區(qū)的

14、各有1個(gè)殘基，而處于禁阻區(qū)的只有殘基Ser112。通過(guò)我們對(duì)這個(gè)蛋白本身的了解可知，Ser112為該水解酶的催化三聯(lián)體，其模板蛋白的Ser112同樣處于禁阻區(qū)。 接下來(lái)我們看看ERRAT的結(jié)果，該結(jié)果中Overall quality factor值越高越好，一般高解析度的晶體結(jié)構(gòu)該值可以達(dá)到95，而對(duì)于解析度一般的來(lái)說(shuō)該值只能到91%左右。本例中的ERRAT值為89.928,已經(jīng)比較接近低解析度的晶體結(jié)構(gòu)了，但是應(yīng)該還有繼續(xù)改進(jìn)的空間。在圖中存在的兩條誤差限表示的是位于其線以上的區(qū)域有多大的可能性是有問(wèn)題的區(qū)域。根據(jù)這一結(jié)果，可以看出從殘基120-150之間是一個(gè)需要高度注意的區(qū)域，另一個(gè)需要注意的區(qū)域是250-255。從BphD的PDB結(jié)構(gòu)來(lái)看這兩段主要是loop區(qū)，本身具有較大的彈性，因此再接下來(lái)的過(guò)程中可能需要重點(diǎn)關(guān)注這一段結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。其他的參數(shù)如verify_3D等數(shù)值較好，在本例中未詳細(xì)給出，將在下一個(gè)修改版中放出首先，我們考慮采用計(jì)算量較少的chiron服務(wù)器對(duì)模建結(jié)構(gòu)的clash進(jìn)行處理。其結(jié)果給出原始蛋白結(jié)構(gòu)中存在的結(jié)構(gòu)間的沖突以及其修正后的結(jié)果與原始結(jié)構(gòu)的疊合結(jié)果。接下來(lái)我們利用SAVES對(duì)于經(jīng)過(guò)處理的蛋