《受體研究技術(shù)》PPT課件

1、受體研討技術(shù)受體研討技術(shù)Techniques in receptor research Techniques in receptor research 相關(guān)協(xié)助 需求相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎 fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研討機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體運(yùn)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以協(xié)助研討者更高效的尋覓并評(píng)價(jià)該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜的運(yùn)用型檢索平臺(tái) 需求相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)效力信

2、息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進(jìn)展咨詢，等待您的參與第八章第八章 組織化學(xué)技術(shù)在受體定位中的運(yùn)用組織化學(xué)技術(shù)在受體定位中的運(yùn)用第一節(jié)第一節(jié) 在受體定位中免疫組化的原理和方法在受體定位中免疫組化的原理和方法免疫組化的原理免疫組化的原理免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry)其主要原理是其主要原理是用標(biāo)志的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原用標(biāo)志的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(受體受體)進(jìn)展免疫化進(jìn)展免疫化學(xué)反響學(xué)反響,經(jīng)過組織化學(xué)呈色后用顯微鏡察看受體在組織細(xì)胞經(jīng)過組織化學(xué)呈色后用顯微鏡察看受體在

3、組織細(xì)胞中的分布和定位。中的分布和定位。 膜受體或核受體膜受體或核受體Ag制備相應(yīng)的特異性抗體制備相應(yīng)的特異性抗體標(biāo)志抗體標(biāo)志抗體免疫組織化學(xué)測定免疫組織化學(xué)測定 免疫組織化學(xué)優(yōu)缺陷免疫組織化學(xué)優(yōu)缺陷 高特異性高特異性: 抗原抗體反響是特異性強(qiáng)抗原抗體反響是特異性強(qiáng),識(shí)別才干可到達(dá)單個(gè)氨基酸程度識(shí)別才干可到達(dá)單個(gè)氨基酸程度. 高度敏感性高度敏感性: 運(yùn)用高敏感的和高親和力的抗體運(yùn)用高敏感的和高親和力的抗體 可檢出細(xì)胞和組織內(nèi)超微量的抗原成份。可檢出細(xì)胞和組織內(nèi)超微量的抗原成份。 高分辨才干高分辨才干: 經(jīng)呈色反響經(jīng)呈色反響 ,在受體原位構(gòu)成有色沉淀或熒光在受體原位構(gòu)成有色沉淀或熒光, 其分辨才

4、干遠(yuǎn)大于放射自顯影技術(shù)。其分辨才干遠(yuǎn)大于放射自顯影技術(shù)。 免疫組織化學(xué)方法獨(dú)一的缺陷是免疫組織化學(xué)方法獨(dú)一的缺陷是 無法測定受體無法測定受體-配基反響的配基反響的 親和性親和性(Kd值值) 包括包括1.抗原抗原(受體受體)提取和純化提取和純化 抗原可為完好蛋白或一段特異性片段。抗原可為完好蛋白或一段特異性片段。 2.免疫動(dòng)物或細(xì)胞交融免疫動(dòng)物或細(xì)胞交融(單克隆抗體單克隆抗體)。3.抗體效價(jià)檢測和提取?？贵w效價(jià)檢測和提取。4.抗體標(biāo)志?？贵w標(biāo)志。5.細(xì)胞和組織標(biāo)本的制備。細(xì)胞和組織標(biāo)本的制備。6. 免疫組織化學(xué)反響和顯色。免疫組織化學(xué)反響和顯色。 7.察看和記錄結(jié)果。察看和記錄結(jié)果。 免疫組織化

5、學(xué)的全部過程免疫組織化學(xué)的全部過程免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備抗原抗原(受體受體)的準(zhǔn)確顯示和定位與制備的組織和細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量親密相關(guān)的準(zhǔn)確顯示和定位與制備的組織和細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量親密相關(guān) 細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞和組織的固定細(xì)胞和組織的固定 組織切片組織切片 *細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞標(biāo)本 :細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片 組織標(biāo)本組織標(biāo)本: 取新穎組織取新穎組織,速凍或立刻用固定劑固定速凍或立刻用固定劑固定. 堅(jiān)持細(xì)胞和組織的原有構(gòu)造堅(jiān)持細(xì)胞和組織的原有構(gòu)造, 防止組織自溶防止組織自溶.不僅使細(xì)胞和組織不僅使細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止和抑制外源

6、性和內(nèi)源性酶活性，更重要的內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止和抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限制地保管是最大限制地保管 細(xì)胞和組織的抗原性及防止抗原的分散。細(xì)胞和組織的抗原性及防止抗原的分散。 *細(xì)胞和組織的固定細(xì)胞和組織的固定 1 固定劑普通為醛類固定劑和醇類固定劑固定劑普通為醛類固定劑和醇類固定劑 醛類固定劑醛類固定劑醛類為交聯(lián)劑，其作用是交聯(lián)組織中的氨基，保管抗原于原位。其醛類為交聯(lián)劑，其作用是交聯(lián)組織中的氨基，保管抗原于原位。其特點(diǎn)是組織穿透力強(qiáng)，收減少。特點(diǎn)是組織穿透力強(qiáng)，收減少。 常見有常見有:福爾馬林福爾馬林 , 多聚甲醛多聚甲醛 等等丙酮及醇類固定劑丙酮及醇類固定劑 該類固定劑為沉淀

7、劑該類固定劑為沉淀劑, 其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖, 組織穿透性很強(qiáng)組織穿透性很強(qiáng), 保管抗原的免疫活性較好保管抗原的免疫活性較好 . 如乙醇如乙醇 ,氯仿氯仿, 冰醋酸冰醋酸 等等固定組織時(shí)應(yīng)留意固定組織時(shí)應(yīng)留意: *力求堅(jiān)持組織新穎力求堅(jiān)持組織新穎, 勿使其枯燥勿使其枯燥, 盡快固定處置盡快固定處置. *組織塊不易過大過厚組織塊不易過大過厚, 必需小于必需小于 2cm x 1.5cm x 0.3cm, 尤其是組織塊厚度須堅(jiān)持在尤其是組織塊厚度須堅(jiān)持在0.3cm 以內(nèi)以內(nèi). *固定劑必需有足夠的量固定劑必需有足夠的量, 在體積上普通大于組織在體積上普通大于組織20倍。倍。

8、*組織固定后組織固定后, 應(yīng)充分水洗應(yīng)充分水洗, 去除固定劑去除固定劑, 以減少固以減少固定劑呵斥的人為假像定劑呵斥的人為假像.載玻片處置載玻片處置 *組織切片組織切片冰凍切片冰凍切片切片厚度普通為切片厚度普通為 6m ,神經(jīng)組織的研討要求切片厚度在神經(jīng)組織的研討要求切片厚度在20-100m最突出的優(yōu)點(diǎn)是可以較好地保管多種抗原的免疫活性最突出的優(yōu)點(diǎn)是可以較好地保管多種抗原的免疫活性,尤其是細(xì)胞尤其是細(xì)胞外表抗原外表抗原(如膜受體如膜受體)更應(yīng)采用冰凍切片更應(yīng)采用冰凍切片.冰凍時(shí)留意減少冰晶構(gòu)成冰凍時(shí)留意減少冰晶構(gòu)成. 石蠟切片石蠟切片其優(yōu)點(diǎn)是組織構(gòu)造保管良好其優(yōu)點(diǎn)是組織構(gòu)造保管良好, 在病理和

9、回想性研討中有較大的適用在病理和回想性研討中有較大的適用價(jià)值價(jià)值, 能延續(xù)切片能延續(xù)切片, 組織構(gòu)造明晰組織構(gòu)造明晰, 抗原定位準(zhǔn)確抗原定位準(zhǔn)確. 振動(dòng)切片振動(dòng)切片用振動(dòng)切片機(jī)用振動(dòng)切片機(jī) (Vibratome) , 對(duì)新穎組織對(duì)新穎組織 切片切片, 組織不用固定和冰凍組織不用固定和冰凍,也沒有石蠟包埋也沒有石蠟包埋.免疫組織化學(xué)方法免疫組織化學(xué)方法 免疫熒光組織化學(xué)免疫熒光組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué) 免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反響的原理，免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反響的原理， 先將先將知的抗體標(biāo)志上熒光素，知的抗體標(biāo)志上熒光素， 再用這種熒光抗體作為探針檢再用這種熒光抗體作

10、為探針檢測細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原。測細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原。 (一一) 免疫熒光組織化學(xué)免疫熒光組織化學(xué) 由于免疫組織化學(xué)的特異性、快速性和在細(xì)胞程度定由于免疫組織化學(xué)的特異性、快速性和在細(xì)胞程度定位的敏感性與準(zhǔn)確性，位的敏感性與準(zhǔn)確性， 免疫熒光組織化學(xué)是免疫組織化免疫熒光組織化學(xué)是免疫組織化學(xué)中廣泛運(yùn)用于受體定位的技術(shù)之一學(xué)中廣泛運(yùn)用于受體定位的技術(shù)之一 免疫熒光組織化學(xué)免疫熒光組織化學(xué) 分直接法分直接法, 夾心發(fā)夾心發(fā), 間接法和補(bǔ)體法間接法和補(bǔ)體法. 其中直接法和間接法最為常用。其中直接法和間接法最為常用。 直接法直接法 用知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，用知特異性抗體與熒光素結(jié)合，

11、制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞中的抗原相結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見抗直接與細(xì)胞中的抗原相結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光. 間接法間接法 先用先用Ab1與與 組織組織Ag結(jié)合結(jié)合,再用再用標(biāo)志熒光的標(biāo)志熒光的Ab2與與Ab1結(jié)合結(jié)合構(gòu)成抗原構(gòu)成抗原-抗體抗體-熒熒光抗體復(fù)合物光抗體復(fù)合物 染色方法染色方法: BSA封鎖封鎖-PBS沖洗沖洗-一抗一抗- PBS沖洗沖洗-二二抗抗- PBS沖洗沖洗-(防熒光淬滅封固劑防熒光淬滅封固劑 或或90% 甘油甘油 PBS )封片封片A.用免疫熒光組織化學(xué)間接法顯示角質(zhì)細(xì)胞生長因子受體用免疫熒光組織化學(xué)間接法顯示角質(zhì)細(xì)

12、胞生長因子受體(Keratinocytew Growth Factor receptor, KGFR)定位于細(xì)胞的細(xì)胞膜。定位于細(xì)胞的細(xì)胞膜。B.在在KGFR抗體孵抗體孵育液中參與過量育液中參與過量KGFR，染色結(jié)果為陰性。標(biāo)尺：，染色結(jié)果為陰性。標(biāo)尺：50um , (Yuan et al. Gastroenterology 2002, 122(Suppl):866) 免疫熒光組織化學(xué)間接法免疫熒光組織化學(xué)間接法雙重免疫熒光染色雙重免疫熒光染色 雙重免疫熒光染色可在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上同時(shí)顯示兩種受體雙重免疫熒光染色可在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上同時(shí)顯示兩種受體 直接法直接法A 抗體用異硫氫酸熒光素抗體

13、用異硫氫酸熒光素(FITC) 標(biāo)志標(biāo)志 B 抗體用得克薩斯紅抗體用得克薩斯紅 (TR) 或四乙基羅丹名或四乙基羅丹名 (TRITC) 標(biāo)志標(biāo)志 按適當(dāng)比例混合按適當(dāng)比例混合 一抗標(biāo)志組織抗原標(biāo)志組織抗原是目前最廣泛運(yùn)用的雙重免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)。所用的一抗必需是來是目前最廣泛運(yùn)用的雙重免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)。所用的一抗必需是來自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體 (例如：例如：A抗體為多克隆抗體，來自抗體為多克隆抗體，來自家兔。家兔。B抗體為單克隆抗體，來自小鼠抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。二抗為兩種不同熒光素標(biāo)志。二抗為兩種不同熒光素標(biāo)志 (如如 FITC和和TR) 抗

14、產(chǎn)生一抗的不同種屬動(dòng)物的抗產(chǎn)生一抗的不同種屬動(dòng)物的IgG (例如：例如：FITC標(biāo)志的標(biāo)志的羊抗兔羊抗兔IgG， TR標(biāo)志的羊抗小鼠標(biāo)志的羊抗小鼠IgG)。間接法間接法(二二) 免疫酶組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué) 它是在抗原抗體特異反響存在的前提下，它是在抗原抗體特異反響存在的前提下， 借助酶組織化借助酶組織化學(xué)的手段，檢測某種物質(zhì)在組織細(xì)胞中的定位：學(xué)的手段，檢測某種物質(zhì)在組織細(xì)胞中的定位： 即先將抗即先將抗體與酶銜接，抗體與組織內(nèi)特異抗原反響，再借酶對(duì)底物體與酶銜接，抗體與組織內(nèi)特異抗原反響，再借酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具一定電子的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具

15、一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)展細(xì)胞外表及細(xì)胞內(nèi)各種密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)展細(xì)胞外表及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成份的定位抗原成份的定位. 酶催化的底物必需是特異的且易被顯示，所構(gòu)成的產(chǎn)物易酶催化的底物必需是特異的且易被顯示，所構(gòu)成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下察看；于光鏡或電鏡下察看； 所構(gòu)成的終產(chǎn)物沉淀必需穩(wěn)定所構(gòu)成的終產(chǎn)物沉淀必需穩(wěn)定, 即終產(chǎn)物不能從酶活性部位即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，向周圍組織彌散， 影響組織學(xué)定位。影響組織學(xué)定位。 酶標(biāo)志過程中，酶與抗體銜接不影響二者的活性。酶標(biāo)志過程中，酶與抗體銜接不影響二者的活性。被檢測組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)志酶一樣的內(nèi)源性酶或類似被檢測組

16、織中，不應(yīng)存在與標(biāo)志酶一樣的內(nèi)源性酶或類似物物 用于標(biāo)志的酶應(yīng)具備以下特點(diǎn)用于標(biāo)志的酶應(yīng)具備以下特點(diǎn)辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 (Horsh Radish Peroxidase, HRP) 具有穩(wěn)定性強(qiáng)和反具有穩(wěn)定性強(qiáng)和反響特異高等優(yōu)點(diǎn)響特異高等優(yōu)點(diǎn), 且主要分布于植物中且主要分布于植物中, 是目前運(yùn)用最多的酶標(biāo)志物是目前運(yùn)用最多的酶標(biāo)志物. 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 (Glucose Oxidase, GOD)也較為常用也較為常用 最常見的酶標(biāo)志物最常見的酶標(biāo)志物 HRP的特異底物為的特異底物為H2O2，在分解，

17、在分解H2O2過程中，與過程中，與H2O2構(gòu)成復(fù)合物構(gòu)成復(fù)合物. 目前運(yùn)用最為廣泛的免疫酶組織化學(xué)方法目前運(yùn)用最為廣泛的免疫酶組織化學(xué)方法:*過氧化物酶過氧化物酶-抗過氧化物酶法抗過氧化物酶法 (Peroxidase Antiperoxidase method, PAP 法法) *卵白素卵白素-生物素生物素-過氧化物酶復(fù)合物法過氧化物酶復(fù)合物法 (Avidin Biotin-Peroxidase Complex Method, ABC 法法) 該方法的根本原理為 PAP 復(fù)合物中的抗HRP抗體和第一抗體來自一樣種屬的動(dòng)物，特異性一抗與組織細(xì)胞中抗原結(jié)合，二抗作為橋抗體將過氧化物酶抗過氧化物酶抗

18、體復(fù)合物(PAP)銜接在與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合的一抗上. 過氧化物酶抗過氧化物酶法過氧化物酶抗過氧化物酶法 (PAP 法法) ABC 復(fù)合物是將 HRP 銜接在生物素上,再將生物素-HRP與卵白素結(jié)合而成。 ABC法的根本原理是特異性一抗與組織細(xì)胞中抗原結(jié)合， 生物素標(biāo)志的二抗再與一抗結(jié)合， ABC復(fù)合物中的卵白素分別銜接生物素標(biāo)志的二抗和生物素標(biāo)志的HRP,最后進(jìn)展顯色定位。 卵白素卵白素-生物素生物素-過氧化物酶復(fù)合物法過氧化物酶復(fù)合物法(Avidin Biotin-Peroxidase Complex Method, ABC法法 ).A.用免疫酶組織化學(xué)用免疫酶組織化學(xué)ABC法顯示甲狀腺激

19、素受體法顯示甲狀腺激素受體2在大鼠中縫核神經(jīng)無細(xì)在大鼠中縫核神經(jīng)無細(xì)胞核中的定位。胞核中的定位。B.用免疫前血清替代抗甲狀腺激素受體用免疫前血清替代抗甲狀腺激素受體2抗體，所染色結(jié)抗體，所染色結(jié)果為陰性。標(biāo)尺：果為陰性。標(biāo)尺：50um.(YUAN ET AL. brain Research 2000,868:22) 免疫酶組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué)ABC法法第二節(jié)第二節(jié) 在受體定位中原位雜交組織化學(xué)的原理和方法在受體定位中原位雜交組織化學(xué)的原理和方法原位雜交組織化學(xué)原位雜交組織化學(xué) (In Situ hybridization Histochemistry) 是運(yùn)用帶有標(biāo)志物的知堿基序列為探針是運(yùn)

20、用帶有標(biāo)志物的知堿基序列為探針 (Probe) 與與組織、細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對(duì)的原那么進(jìn)展特組織、細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對(duì)的原那么進(jìn)展特異性結(jié)合，構(gòu)成雜交體，然后用與標(biāo)志物相應(yīng)的檢測異性結(jié)合，構(gòu)成雜交體，然后用與標(biāo)志物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，經(jīng)過放射自顯影或免疫組織化學(xué)方法在核酸原系統(tǒng)，經(jīng)過放射自顯影或免疫組織化學(xué)方法在核酸原有的位點(diǎn)進(jìn)展細(xì)胞內(nèi)定位察看。有的位點(diǎn)進(jìn)展細(xì)胞內(nèi)定位察看。 原位雜交組織化學(xué)是研討受體的原位雜交組織化學(xué)是研討受體的mRNA在特定細(xì)胞中表達(dá)和在特定細(xì)胞中表達(dá)和定位的有力工具。定位的有力工具。 許多受體有不同的亞型，有些受體亞型在藥理學(xué)上僅有非常許多受體有不同的亞型，有些受

21、體亞型在藥理學(xué)上僅有非常細(xì)微的差別。由于不同的亞型由不同的基因編碼，檢測其相應(yīng)細(xì)微的差別。由于不同的亞型由不同的基因編碼，檢測其相應(yīng)的的mRNA可對(duì)不同的受體亞型進(jìn)展鑒別和定位。可對(duì)不同的受體亞型進(jìn)展鑒別和定位。 一一 探針探針 常用的有常用的有DNA寡核苷酸探針和酶促合成的寡核苷酸探針和酶促合成的RNA探針探針. DNA寡核苷酸探針設(shè)計(jì)和合成方法簡便寡核苷酸探針設(shè)計(jì)和合成方法簡便,探針序列較短探針序列較短 (普普通為通為30-40 個(gè)堿基個(gè)堿基)，組織穿透性強(qiáng)，但其敏感性低于，組織穿透性強(qiáng)，但其敏感性低于RNA探針探針. RNA探針由插入到載體中的探針由插入到載體中的cDNA轉(zhuǎn)錄而來轉(zhuǎn)錄而來

22、,在適當(dāng)條件在適當(dāng)條件下，可轉(zhuǎn)錄下，可轉(zhuǎn)錄cDNA的完好序列的完好序列 ,因此因此RNA探針可耐受非常嚴(yán)探針可耐受非常嚴(yán)厲的雜交條件，從而獲得強(qiáng)雜交信號(hào)及低背景的理想結(jié)果厲的雜交條件，從而獲得強(qiáng)雜交信號(hào)及低背景的理想結(jié)果. 標(biāo)志探針標(biāo)志探針 *最常用的標(biāo)志物為放射性同位素最常用的標(biāo)志物為放射性同位素3H的分辨力高的分辨力高,能得到良好的細(xì)胞定位，但放射自顯影時(shí)間能得到良好的細(xì)胞定位，但放射自顯影時(shí)間長，普通需幾周或更長長，普通需幾周或更長 . 32P能量最大能量最大,放射自顯影時(shí)間較短，僅需幾天，但分辨力放射自顯影時(shí)間較短，僅需幾天，但分辨力低低 . 35S標(biāo)志的探針做原位雜交，其分辨力不及標(biāo)

23、志的探針做原位雜交，其分辨力不及3H，但明顯優(yōu)，但明顯優(yōu)于于32P，能得到良好的定位，放射自顯影時(shí)間約，能得到良好的定位，放射自顯影時(shí)間約10天，比天，比32P長，但比長，但比3H短短. 35S為目前原位雜交放射性標(biāo)志物中運(yùn)用最為廣泛的一種同位素為目前原位雜交放射性標(biāo)志物中運(yùn)用最為廣泛的一種同位素 *另一類常見的標(biāo)志物為地高辛另一類常見的標(biāo)志物為地高辛 (Digoxingenin) 地高辛分子可被特異性抗體檢測地高辛分子可被特異性抗體檢測, 方法簡便方法簡便, 無放射性污染問題無放射性污染問題, 且分辨且分辨力比較高。力比較高。缺乏之處在于其敏感性較放射自顯影低，且定量較為困難缺乏之處在于其敏

24、感性較放射自顯影低，且定量較為困難 .二二 原位雜交組織化學(xué)反響原位雜交組織化學(xué)反響 1 放射性標(biāo)志放射性標(biāo)志RNA 探針的原位雜交探針的原位雜交 *雜交前處置雜交前處置: 雜交前用一系列溶液預(yù)處置雜交前用一系列溶液預(yù)處置,目的是經(jīng)過目的是經(jīng)過降低探針與組織切片的靜電結(jié)合，以減低非特異性背景降低探針與組織切片的靜電結(jié)合，以減低非特異性背景著色著色. *雜交反響雜交反響: 溫度普通在溫度普通在37-420C左右左右 ;過夜雜交過夜雜交; RNA 探針在參與探針在參與到雜交液之前，到雜交液之前， 必需加熱至必需加熱至800C變性變性, 反響反響10 分鐘后，速置于冰分鐘后，速置于冰上上. 探針的濃

25、度普通為探針的濃度普通為0.5-5.0g/ml. *雜交后處置雜交后處置: 包括包括RNA酶消化及一系列不同濃度不同溫酶消化及一系列不同濃度不同溫度的鹽溶液漂洗度的鹽溶液漂洗. 2 放射性標(biāo)志寡核苷酸探針的原位雜交放射性標(biāo)志寡核苷酸探針的原位雜交 用寡核苷酸探針進(jìn)展原位雜交，其嚴(yán)厲度可高于用寡核苷酸探針進(jìn)展原位雜交，其嚴(yán)厲度可高于RNA探針。緣由是探針。緣由是寡核苷酸探針較短及寡核苷酸探針較短及 DNA：RNA雜交體的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于雜交體的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于RNA:RNA雜雜交體。通常雜交溫度為交體。通常雜交溫度為370C，長于，長于36個(gè)堿基的寡核苷酸探針雜交溫度個(gè)堿基的寡核苷酸探針雜交溫度可提高到

26、可提高到420C。雜交溫度低，所需的雜交時(shí)間要長，通常需過夜。常。雜交溫度低，所需的雜交時(shí)間要長，通常需過夜。常用探針濃度為用探針濃度為0.5g/ml。 原位雜交組織化學(xué)反響的檢測方法原位雜交組織化學(xué)反響的檢測方法 放射自顯影檢測放射自顯影檢測 將雜交后的切片將雜交后的切片-浸入核乳膠浸入核乳膠 -取出涼干取出涼干-防入暗盒密封防入暗盒密封-于于 40C冰箱內(nèi)曝光冰箱內(nèi)曝光-曝光時(shí)間曝光時(shí)間 (32P約需約需4-7天，天，3H約需約需2-3月，月，35S約需約需2-4周周 ) 用用35S標(biāo)志的寡核苷酸探針顯示谷氨酸脫羧酶標(biāo)志的寡核苷酸探針顯示谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decar

27、boxylase,GAD)的兩種不同方的兩種不同方式式GAD65和和GAD67 mRNA在大鼠內(nèi)側(cè)腳間核在大鼠內(nèi)側(cè)腳間核(Endopeduncular Nicleus,EP)的分布的分布. GAD65mRNA的表達(dá)在的表達(dá)在EP頭側(cè)頭側(cè)(A)明顯高于明顯高于EP尾側(cè)尾側(cè)(B)。與。與GAD65相反，相反， GAD67的的mRNA表達(dá)表達(dá)在在EP頭側(cè)頭側(cè)(C)明顯低于明顯低于EP尾側(cè)尾側(cè)(D)。標(biāo)尺：。標(biāo)尺：20um.(Yuan et al. Neuroscience 1997,78:87)放射性標(biāo)志寡核苷酸探針的原位雜交放射性標(biāo)志寡核苷酸探針的原位雜交 3 地高辛標(biāo)志的地高辛標(biāo)志的RNA探針的

28、原位雜交探針的原位雜交 用規(guī)范的免疫組織化學(xué)檢測用規(guī)范的免疫組織化學(xué)檢測,銜接堿性磷酸酶的抗地高辛抗體與雜交銜接堿性磷酸酶的抗地高辛抗體與雜交體中的地高辛結(jié)合，用硝基藍(lán)四唑體中的地高辛結(jié)合，用硝基藍(lán)四唑(NBT)作為組織化學(xué)的底物進(jìn)展顯作為組織化學(xué)的底物進(jìn)展顯色色. 4 原位雜交組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)雙重染色法原位雜交組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)雙重染色法 雙重染色法是先后在同一張切片或相鄰切片用原位雜交組織化學(xué)和免雙重染色法是先后在同一張切片或相鄰切片用原位雜交組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)進(jìn)展染色，在同一細(xì)胞同時(shí)顯示編碼某種受體的疫組織化學(xué)進(jìn)展染色，在同一細(xì)胞同時(shí)顯示編碼某種受體的mRNA和相和相應(yīng)的受

29、體或與其共存的其它蛋白質(zhì)和多肽。應(yīng)的受體或與其共存的其它蛋白質(zhì)和多肽。 鄰片法可使原位雜交和免疫組化染色都獲得理想的結(jié)果，易勝利，但鄰片法可使原位雜交和免疫組化染色都獲得理想的結(jié)果，易勝利，但易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。 同一張切片上進(jìn)展雙重染色法可抑制這些誤差，但第一次染色總要不同一張切片上進(jìn)展雙重染色法可抑制這些誤差，但第一次染色總要不同程度地影響第二次染色。同程度地影響第二次染色。 由于由于mRNA易被染色過程中污染有少量易被染色過程中污染有少量RNA酶的液體所降解，酶的液體所降解，因此實(shí)際中往往先進(jìn)展原位雜交組織化學(xué)染色，但對(duì)某些較敏感因此實(shí)際中往往先進(jìn)展原位雜交組織化學(xué)染色，但對(duì)某些較敏感易喪失的蛋白質(zhì)或生物活性物質(zhì)，需求先進(jìn)展免疫組織化學(xué)染色，易喪失的蛋白