水曲柳中荷包花苷A的分離及測定

1、 科 研 訓(xùn) 練 報(bào) 告水曲柳中荷包花苷A的分離及檢測學(xué) 生 姓 名專 業(yè)學(xué) 號(hào)指 導(dǎo) 教 師學(xué) 院 目的及要求：目的：通過科研訓(xùn)練，使學(xué)生能夠在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下選定課題，完成實(shí)驗(yàn)，并寫出具有一定質(zhì)量的總結(jié)報(bào)告、學(xué)術(shù)論文或申請(qǐng)專利等；學(xué)生在畢業(yè)時(shí)將具有一定創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力、有一定參與實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐的能力以及分析問題和解決問題的能力，為今后獨(dú)立開展科學(xué)研究工作奠定基礎(chǔ)。要求：了解本專業(yè)的科研方法，受到較嚴(yán)格的科學(xué)思維訓(xùn)練。了解本學(xué)科某一方向發(fā)展的歷史概況以及當(dāng)代的某些新發(fā)展和應(yīng)用前景。有較強(qiáng)的語言表達(dá)能力，掌握資料查詢、文獻(xiàn)檢索以及運(yùn)用現(xiàn)代信息技術(shù)獲取相關(guān)信息的基本方法。能夠?qū)δ骋徽n題，進(jìn)行文獻(xiàn)檢

2、索，收集資料，完成文獻(xiàn)綜述。了解科學(xué)論文、學(xué)士論文、碩士論文的國家標(biāo)準(zhǔn)定義，掌握學(xué)士論文的基本內(nèi)容與要求。掌握科學(xué)論文的寫作規(guī)范和寫作的基本方法，具有一定的科學(xué)研究能力。主要內(nèi)容：1、查閱文獻(xiàn)，對(duì)水曲柳中的總苯乙醇苷類成分進(jìn)行提取，可以采用有機(jī)溶劑提取法，摸索最佳的提取的溶劑種類、比例和提取時(shí)間；2、熟悉色譜分離方法的基本操作，熟悉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的使用，熟悉超聲波在中藥有效成分提取中的使用；根據(jù)已知化合物的物理化學(xué)性質(zhì)，選擇分離目標(biāo)化合荷包花苷A的有效介質(zhì)；3、設(shè)計(jì)對(duì)分離的荷包花苷A進(jìn)行快速檢測的方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告進(jìn)行分析。成績： 指導(dǎo)教師評(píng)語：水曲柳中荷包花苷A的分離及測定摘要:目的從水曲柳中分

3、離出較純的荷包花苷A。方法采用大孔樹脂吸附及硅膠柱層析提高對(duì)提取物的分離程度，采用薄層色譜法與標(biāo)準(zhǔn)樣品比對(duì)進(jìn)行檢測。結(jié)果采用D101大孔樹脂（Ø6cm，35cm高）吸附柱，使用乙醇為洗脫液，初步獲得含有荷包花苷A的混合提取物，再通過硅膠柱（Ø4cm，24cm高）層析柱，使用乙酸乙酯、甲醇和甲酸為流動(dòng)相，分離出較純的荷包花苷A。結(jié)論大孔樹脂吸附及硅膠柱層析提取條件工藝簡單，成本低，節(jié)約能源，可增加水曲柳的利用率。關(guān)鍵詞:水曲柳；大孔樹脂；荷包花苷A；薄層色譜；硅膠柱層析第一章 引言水曲柳（Fraxinusm andschurica Rupr.）是一種落葉喬木，高度可達(dá)30m，

4、直徑超過1 m，主要分布于我國大興安嶺東部和小興安嶺等地。水曲柳為優(yōu)質(zhì)木材，但水曲柳皮卻沒有被充分開發(fā)利用，只在民間作為抗風(fēng)濕的偏方使用，其化學(xué)成分國外有見報(bào)道，國內(nèi)很少有人研究，其藥效價(jià)值還有待開發(fā)1。荷包花苷A（calceolarioside A）屬于苯乙醇苷類化合物，已發(fā)現(xiàn)的苯乙醇苷類化合物在自然界的分布相當(dāng)廣泛，幾乎分布在各個(gè)科屬中，在較進(jìn)化的雙子葉植物綱合瓣花亞綱中，特別集中于玄參目和唇形目中，如：玄參科、木犀科、唇形科、馬錢科等，而水曲柳正是木犀科植物。由于這類化合物分布廣，藥理作用強(qiáng),目前對(duì)此類化合物的研究也逐漸成為學(xué)者們的研究重點(diǎn)2。采用大孔樹脂進(jìn)行天然化合物的分離純化，常用于

5、分離純化苷類化合物，同傳統(tǒng)方法如溶劑萃取法相比，溶劑用量大為減少，在操作全過程中一般只使用水與乙醇作為溶劑，具有無殘留，無污染等特點(diǎn)。D101大孔樹脂樹脂屬于非極性，可用于吸附皂苷類及某些生物堿類化合物，本實(shí)驗(yàn)主要用于除去樣品中的不需要的糖。硅膠層析的主要特點(diǎn)是能通過對(duì)混合物質(zhì)中的不同成分吸附保留時(shí)間的差異，達(dá)到分離提純的目的。其原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程?？捎糜诿摮紵N物質(zhì)或中草藥有效成分的分離提純，高純度物質(zhì)的制備等3。1.1 水曲柳水曲柳屬木犀科、梣屬植物

6、，漸危種，是古老的殘遺植物，分布區(qū)雖較廣，但多為零星散生，是國家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。因砍伐過度，數(shù)量日趨減少，目前大樹已不多見。實(shí)驗(yàn)材料為木樨科植物水曲柳的樹皮，功效包括清熱燥濕，清肝明目，活血調(diào)經(jīng)。主要用于痢疾、牛皮癬、月經(jīng)不調(diào)、白帶等疾病。成分主要含有馬粟樹皮甙和微量的馬粟樹皮素；也含有蟲白蠟，蟲白蠟含酯類、游離酸、游離醇、烴類和樹脂等。1.2 大孔樹脂吸附法大孔樹脂吸附分離技術(shù)是以采用特殊的吸附劑，從中藥材提取液中有選擇地吸附其中的有效成分，除去無效成分的一種提取精制的新工藝。此外，大孔吸附樹脂還可應(yīng)用于中藥有效成分樣品組成含量測定前的預(yù)分離。該方法具有設(shè)備簡單、操作方便、節(jié)省能源、成本

7、低、產(chǎn)品純度高、不吸潮等優(yōu)點(diǎn)，因此大孔樹脂吸附法在中藥研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛。將這種方法應(yīng)用于中藥有效成分的分離取得了相當(dāng)顯著的成果。近年來，大孔吸附樹脂法已廣泛地應(yīng)用于中藥有效成分的分離與精制。目前，該技術(shù)已在國內(nèi)廣泛用于純化苷類、黃酮類、生物堿類成分。隨著有關(guān)基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入，以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)的進(jìn)一步完善，大孔樹脂精制純化技術(shù)必將成為推動(dòng)中藥現(xiàn)代化的重要手段。1.3 硅膠柱層析硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離， 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。1.4 薄層色譜法薄層色譜

8、，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法。薄層色譜法同時(shí)也是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，使在移動(dòng)相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成

9、分的互相分離的目的。第二章 方法與結(jié)果2.1儀器與材料2. 1.1儀器GZX-9070 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）,恒溫水浴鍋B-260，RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。2. 1.2試劑水曲柳采自長白山；標(biāo)準(zhǔn)品；其它試劑為薄層層析硅膠HG/T2354-92 G&G254化學(xué)純（青海洋化工有限公司）；D101大孔樹脂；乙醇，乙酸乙酯，甲醇，磷鉬酸分析純（北京化工廠）；甲酸，CMC（羧甲基纖維素鈉）（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。2.2方法與結(jié)果2.2.1樣品處理用95%乙醇浸泡水曲柳皮過夜，將浸泡后的上清液蒸發(fā)濃縮至膏狀物質(zhì)，然后通過水分散，再

10、依次經(jīng)過乙酸乙酯和正丁醇萃取。取得正丁醇萃取的浸膏33.47g，加250mL水分散，制得待測樣品液。2.2.2樣品分離2. 2. 2.1大孔樹脂分離先進(jìn)行大孔樹脂活化，用2倍體積95%乙醇浸泡大孔樹脂24h。把95%乙醇浸泡過的大孔樹脂用水分散加入Ø6cm的柱中，加35cm高，體積約為989cm3。用水和乙醇各2L依次沖洗，重復(fù)一次。上樣前共加3L水沖洗大孔樹脂，直至流出液中不含有乙醇（檢測：加水不出現(xiàn)油狀現(xiàn)象）。上樣250mL后用2L水沖洗，直至流出液澄清（接近無色）。上樣完成后，柱中樣品占到柱高的25處；剩余的樣品液中不溶于水的粘稠沉淀成分不明，收集待測。用30%乙醇約2.5L洗

11、脫樣品，收集6瓶250mL流出液，編號(hào)，然后改用50%乙醇洗脫樣品，收集8瓶250mL流出液，編號(hào)，最后用回收乙醇沖洗，收集全部流出液，直至流出液呈無色。將流出液、分別合并，蒸發(fā)濃縮為膏狀物質(zhì)，同時(shí)獲得回收乙醇。2. 2. 2.2硅膠柱層析分離稱取硅膠G 116.87g，加入溶劑（乙酸乙酯：甲醇：甲酸=36：4：1）后用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，將攪拌均勻的勻漿緩慢倒入柱中，不斷加入溶劑直至硅膠沉降完成，高度不再變化（硅膠柱Ø4cm，24cm高，體積約為301cm3）。硅膠柱上樣量為3.5g（30%乙醇洗脫液濃縮至膏狀，加硅膠G攪拌研磨至粉末），打開活塞后，樣品液隨溶劑流出（流速約1.25mL

12、/min）而在硅膠中向下擴(kuò)展。在樣品液（呈淺黃色）擴(kuò)展到硅膠柱底部瓷板之前，將流出的溶劑再加入到硅膠柱中；當(dāng)流出液呈淺黃色時(shí)，即開始收集，第一瓶流出液收集1h，約60mL；從第二瓶至第九瓶每隔40min收集一瓶流出液，流速約1mL/min，每瓶約40mL。2. 2.2. 3薄層色譜檢測采用乙酸乙酯：甲醇：甲酸=18：2：1為擴(kuò)展劑，首先對(duì)大孔樹脂分離出的流出液進(jìn)行檢測，將、和標(biāo)準(zhǔn)品（A+B）（標(biāo)準(zhǔn)品A即荷包花苷A，B為香豆素類化合物）分別點(diǎn)樣，擴(kuò)展，然后先在紫外（254nm）下顯色（黃），再用5%磷鉬酸乙醇溶液顯色（需加熱）。經(jīng)過檢測后，觀察到流出液含有A、B物質(zhì)和另一物質(zhì)（含量高），流出液含

13、有B物質(zhì)（含量高）、A和另一物質(zhì)，流出液僅含有B物質(zhì)。因此，可直接將30%乙醇洗脫液濃縮制得的膏狀物質(zhì)進(jìn)行硅膠柱層析，進(jìn)一步分離純化。通過對(duì)硅膠柱分離出的流出液進(jìn)行檢測，將第一至九瓶流出液和標(biāo)準(zhǔn)品（30%乙醇洗脫液）分別點(diǎn)樣，擴(kuò)展，然后用磷鉬酸乙醇溶液顯色。經(jīng)過檢測后，觀察到流出液僅含有A物質(zhì)，流出液含有A、B物質(zhì)，流出液含有B物質(zhì)（含量高）、A，、流出液含有另一物質(zhì)。觀察的結(jié)果（流出液）如圖，因此，流出液中含有本實(shí)驗(yàn)所需要提取的荷包花苷A。第三章 討論由于荷包花苷A的極性較大，故選擇非極性的D101大孔樹脂樹脂來除去雜質(zhì)，在洗脫時(shí)便使用極性大的乙醇洗脫；采用的大孔吸附樹脂對(duì)苯乙醇苷的吸附量大

14、，解吸附完全，可有效去除糖類等水溶性雜質(zhì)，操作簡便，生產(chǎn)成本低，純化后的提取物中該類成分的純度大幅提高4，為進(jìn)一步充分開發(fā)水曲柳的藥用價(jià)值提供了研究基礎(chǔ)。而由于極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，故在洗脫時(shí)使用極性中等的乙酸乙酯為主的溶劑洗脫，使荷包花苷A的分離純化程度較高。在薄層色譜法檢測時(shí)，由于前期出現(xiàn)了明顯的拖尾，故向洗脫劑中加入了一定量甲酸來調(diào)整，使檢測結(jié)果更確切。該提取工藝簡單，成本低，節(jié)約能源，對(duì)研究水曲柳的提取分離具有一定的參考價(jià)值，適用于其他同類物質(zhì)的提取分離。實(shí)驗(yàn)心得在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，各個(gè)組員相互協(xié)作，在老師的指導(dǎo)下認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)。各位成員在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格要求自己，規(guī)范操作，認(rèn)真尋找實(shí)驗(yàn)失敗原因，積極探討，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，從做實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)會(huì)了很多。雖然，在實(shí)驗(yàn)過程中我們經(jīng)常遇到阻礙和挫折,但是老師積極鼓勵(lì)，認(rèn)真教授，不辭辛勞地講授，讓我們明白了其中的道理。通過實(shí)驗(yàn),我們掌握了基本的實(shí)驗(yàn)技巧，通過撰寫論文，我們學(xué)會(huì)了查閱文獻(xiàn)、參考資料等，掌控了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度，懂得如何處理數(shù)據(jù)，分析結(jié)果，如何跟自己的組員更好的溝通，也學(xué)會(huì)了扎實(shí)動(dòng)手，認(rèn)真分析，仔細(xì)檢驗(yàn)等好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。參考文獻(xiàn)1陳玉娟,張宏桂,孫嚴(yán)彤,王