D-核糖研究動(dòng)態(tài)

1、D-核糖發(fā)酵研究動(dòng)態(tài)D漱糖（D-Ribose），化學(xué)名稱為D-味喃核糖。分子式為 C5H10O5分子量150.13。D-核糖其理化性能為白 色結(jié)晶粉末狀，微有芳香之味，極易吸潮，能溶于水和甲醇，在水中有在過飽和傾向，以糖漿形式存在。微溶于乙醇，不溶于醍、苯、丙酮及氯仿。熔點(diǎn)：86-87C，比旋度：-19.5 -25 （24C水中）。D-核糖是五碳糖，以化合物的形式存在于一切細(xì)胞中。對(duì)生物體來說，葡萄糖是一種較好的碳源和能源， 而D寶糖則是一種與生物遺傳物質(zhì)有關(guān)的非常重要的糖類，在生理上具有十分重要的作用。一九零九年， 核糖首先被萊文（Leven）和雅各布斯（Jacb所鑒定。在其后的研究中發(fā)現(xiàn)，

2、D-核糖是rnRNA、tRNA、sRNA、5sRNA等各種RNA的組成糖，也是各種核音酸輔酶的組成糖。通常核糖與磷酸在體內(nèi)一起運(yùn)轉(zhuǎn)。 D-核糖既是體內(nèi)核糖核酸、核昔酸輔酶類的構(gòu)成成份，又是一種還原型誘導(dǎo)物，在各種核糖核酸中承擔(dān)了 重要生物活性功能的作用，在生物體內(nèi)完成極其重要的任務(wù)。在自然界中，D-核糖不以單體形式存在，多年來一直作為昂貴的生物化學(xué)試劑被應(yīng)用。用微生物發(fā)酵 方法大規(guī)模地生產(chǎn)出的 D-核糖，價(jià)格低廉。在醫(yī)藥上是大規(guī)模合成核黃素、病毒哇的主要原料，可大幅度 經(jīng)濟(jì)有效的降低該藥的生產(chǎn)成本。D漱糖嵌入某些物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中是治療艾滋病，以及抗癌、抗病毒的有效藥物。D-核糖本身可以作為藥物，

3、用于治療心肌局部出血，提高心臟局部缺血的耐性和改善心臟功能， 也可以用于治療運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉疼痛，由于缺乏肌腺昔酸脫氫酶導(dǎo)致的強(qiáng)直僵硬以及因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)缺乏磷酸 化酶導(dǎo)致的肌肉疼痛疾病。在食品工業(yè)上，D-核糖可用于合成牛肉香精。1 D-核糖制取方法1.1抽提法D-核糖的制取方法最早是從天然物種抽提。1955年從酵母核糖核酸等原料中制取成功。這一方法產(chǎn)率低、成本高。 1.2化學(xué)合成法1920年發(fā)明了化學(xué)合成法制備 D-核糖。在D-核糖有機(jī)合成法制取的工藝過程中，最早采用汞電極電 解法進(jìn)行合成。以后許多學(xué)者對(duì)化學(xué)合成法制取的工藝進(jìn)行了多次改良，縮短了反應(yīng)步驟。D-核糖化學(xué)合成法經(jīng)改良后，以葡萄糖為原料，

4、經(jīng)氧化、置換、轉(zhuǎn)化、再置換、酸化、內(nèi)酯化、還原等七步反應(yīng)獲得。 但是改良后的化學(xué)合成法仍然沒有解決環(huán)境污染問題。目前D-核糖抽提法、化學(xué)合成法已被微生物發(fā)酵法所取代。1.3微生物發(fā)酵法1.3.1野生菌產(chǎn)生D-核糖關(guān)于利用微生物發(fā)酵 D-核糖的最初報(bào)道是在 1951年。比利時(shí)的西莫納爾特（Simonart）和戈丁 （Godin） 用短密青霉（Penicillum brevicompactum ）在培養(yǎng)液中觀察到微量的 D-核糖，他們用紙層析進(jìn)行了定性研究， 但是沒有記載生成量。約十年以后，在日本氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)、研究進(jìn)入了極為鼎盛時(shí)期的六十年代里，協(xié) 和發(fā)酵的玲木等人，發(fā)現(xiàn)一株未確定名稱的細(xì)菌，在

5、培養(yǎng)液內(nèi)產(chǎn)生D-核糖，1963年作了報(bào)道。D-核糖的生 產(chǎn)受培養(yǎng)基中存在的鎰、鐵、鋅離子的影響。在最適條件下，生成 5.2mg/ml D-核糖。培養(yǎng)基中用磷酸代替 金屬離子，發(fā)酵液內(nèi)則不積累D-核糖而積累7.4mg/ml D-核糖-5-磷酸和磷酸核糖焦磷酸。1966年野田產(chǎn)研的齋藤和杉山用食爬蟲假單胞菌（Pseudomonas reptilivova）進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵液內(nèi)生成 0.72mg/ml D-核糖。這些早期利用微生物生產(chǎn) D-核糖的方法，都是使用野生菌株進(jìn)行研究，產(chǎn)率均很低。1.3.2突變菌株產(chǎn)生D-核糖在發(fā)酵工業(yè)中，繼L-谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)化以后，二十世紀(jì)五十年代末期開展了呈味核音酸的

6、研究工 作。微生物菌種在喋吟核昔代謝過程中，5'-磷酸-D-核糖是喋吟核音形成的前體物質(zhì)。在對(duì)呈味核音酸的研究過程中發(fā)現(xiàn)Bacillus屬的細(xì)菌糖代謝發(fā)生突變后，可以大量的積累D-核糖。D-核糖發(fā)酵研究工作是在對(duì)呈味核音酸研究中延伸出來的分支。國外在七十年代開始大量發(fā)表微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的文獻(xiàn)。在微生物菌種方面有芽抱桿菌、棒狀桿菌、短桿菌、節(jié)桿菌、假單抱桿菌以及酵母菌等等。在應(yīng)用方面報(bào)道較多、產(chǎn)核糖能力較強(qiáng)的菌種是短小芽抱 桿菌、枯草芽抱桿菌。七十年代初期，日本的Sasajima等人在研究微生物菌種突變對(duì)喋吟生物合成中碳水化物代謝的影響時(shí)，由一株芽抱桿菌分離出三株轉(zhuǎn)酮醇酶變異株(

7、 Tramsketolase mutant)。這三株芽抱桿菌 的親株，生長時(shí)需要腺喋吟、黃喋吟，對(duì)8-氮雜鳥喋吟具有抗性，可以生產(chǎn)多量肌昔。它的二株變異株，生長時(shí)需要L-酪氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸，另外一株變異株不能利用D-葡萄糖酸鹽。這些變異株培養(yǎng)于含有葡萄糖12.5%、碳酸鈣1.0%、干酵母2.5%、硫酸鉉1.5%、磷酸氫鈣0.5%、磷酸鈣0.5%,培養(yǎng)基 PH控制在7.0左右，培養(yǎng)6天后D-核糖生成量為35mg/ml。 1.3.3國外D-核糖研究及工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)態(tài)K.Sasajima等人以后對(duì)轉(zhuǎn)酮醇酶突變株經(jīng)過不斷誘變育種，選育出能產(chǎn)生 70mg/ml D-核糖的高產(chǎn)菌株 6。隨著D

8、-核糖發(fā)酵技術(shù)的日益進(jìn)步，在發(fā)酵條件研究方面，經(jīng)過多次改良后，使微生物積累D-核糖達(dá)到90mg/ml，這一產(chǎn)量已超過了谷氨酸的發(fā)酵水平。日本、比利時(shí)等國對(duì)D-核糖微生物發(fā)酵法進(jìn)行了深入研究。七十年代后期，D-核糖開始用微生物發(fā)酵法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，主要作為維生素B2的合成原料、供給食品工業(yè)應(yīng)用以及作為合成抗病毒藥物、稀有糖類的原料。目前發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的年產(chǎn)量已超過2000噸，生產(chǎn)廠家包括德國的BASF和E.Merk,瑞士的Hoffmann-La-Roche，美國的Pfizer和日本的Takeda化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社等。目前國際市場上D-核糖每公斤價(jià)格為800-1000元。1.3.4國內(nèi)D-核糖研

9、究及工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)態(tài)江蘇省微生物研究所有限公司在研究核昔酸的基礎(chǔ)之上，1992年開展了 D-核糖發(fā)酵研究工作。主要對(duì)Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Psendomonas Arthrobacter 等不同類型的 28 株菌種產(chǎn)生戊糖 的能力進(jìn)行了研究。采用誘變育種的方法獲得二株莽草酸營養(yǎng)缺陷型突變株。突變株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)物理 特性鑒定為D-核糖。對(duì)一株Bacillus subtilis JSIM-1018突變株的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究、不斷改進(jìn)，D-核糖搖瓶產(chǎn)量達(dá)92mg/ml。江蘇省微生物研究所 D-核糖發(fā)酵中試研究項(xiàng)目，1994年被列為國家科委生物工

10、程中心 ".五 畋關(guān)項(xiàng)目，攻關(guān)項(xiàng)目編號(hào)為 85-08-02-06。在三噸中試發(fā)酵罐中，D-核糖產(chǎn)量最高達(dá)81.75mg/ml,提 取收率在76%以上。突變株產(chǎn)D-核糖性能穩(wěn)定、代謝產(chǎn)物單一，無其他付產(chǎn)物，發(fā)酵液紙層析檢驗(yàn)，僅出 現(xiàn)D-核糖一個(gè)層析斑點(diǎn)，便于提取該產(chǎn)物，以利于進(jìn)一步應(yīng)用8。目前工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)D-核糖，發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)已成熟。在20M3發(fā)酵罐中，D-核糖產(chǎn)量最高達(dá)85mg/ml，發(fā)酵66小時(shí)時(shí)，D-葡萄糖完全耗盡，代 謝產(chǎn)物單一，發(fā)酵液經(jīng)提取分離精制后得到D-核糖結(jié)晶，產(chǎn)品質(zhì)量符合出口標(biāo)準(zhǔn)，正在銷往國際市場。D-核糖生產(chǎn)菌種及發(fā)酵生產(chǎn)工藝已獲國家專利授權(quán)，專利號(hào)：ZL9511

11、2736.5。1.3.4基因工程菌產(chǎn)生D-核糖目前D-核糖研究已發(fā)展到利用重組DNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)定向育種。重組 DNA技術(shù)從鳥槍法克隆發(fā)展到cDNA克隆。1991年Mlyagawa等人報(bào)道，在枯草芽抱桿菌中利用基因工程技術(shù)克隆葡萄糖酸操縱子構(gòu)建 核糖工程菌。構(gòu)建的核糖工程菌可以積累D-核糖62mg/ml，親株只積累36mg/ml D-核糖，核糖的積累量比親株提高了 72% o2 D-核糖的生成途徑糖的有氧分解的方式之一是磷酸戊糖途徑。磷酸戊糖途徑的主要特點(diǎn)是葡萄糖直接脫氫和脫愈而不經(jīng) 三碳糖階段，葡萄糖可以不通過糖酵解而直接氧化。D-核糖是由葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑里的非氧化性途徑生成，以及以D-葡萄

12、糖酸為中間產(chǎn)物走與葡萄糖脫氫酶和葡萄糖酸激酶有關(guān)的支路途徑，生成D-核糖。在由葡萄糖生成 D-核糖的反應(yīng)中，需要經(jīng)過葡萄糖脫氫酶、葡萄糖酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶這三種脫氫酶的催化反應(yīng)，因此D-核糖在發(fā)酵過程中需要通入大量空氣，發(fā)酵是在好氣條件下進(jìn)行。 到目前為止，有關(guān)D-核糖合成的真正機(jī)制以及突變株的變異內(nèi)容并沒有完全搞清楚，但是對(duì)于D-核糖生產(chǎn)來說，突變株產(chǎn)生了有利于D-核糖積累的糖代謝的變化，使D-核糖的產(chǎn)量大幅度提高，為D-核糖發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。開展D-核糖發(fā)酵代謝控制的基礎(chǔ)理論研究，有助于推動(dòng)D-核糖發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。3 D-核糖發(fā)酵法生產(chǎn)原料微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的

13、主要原料是碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素。碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麥芽糖、乳糖、甘油、糊精以及可溶性淀粉等；有機(jī)氮源可以使用干酵母、 肉膏、酵母膏、蛋白月東、玉米漿、棉子粉、以及大豆粉；無機(jī)鹽為硫酸鉉、磷酸鹽、碳酸鹽以及適量微量 元素。4生產(chǎn)工藝流程及技術(shù)參數(shù)4.1生產(chǎn)工藝流程4.1.1菌種：Bacillus subtilis JSIM-1018.菌株，菌株的遺傳特性：莽草酸營養(yǎng)缺陷型，缺失轉(zhuǎn)酮醇酶。江蘇 省微生物研究所選育并保藏。4.1.2 D-核糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程4.2技術(shù)參數(shù)5 D核糖應(yīng)用前景D我糖在應(yīng)用方面，除了作為生化試劑、合成維生素B2、三氮哇核昔、稀有糖類以外，還可以用D-核糖及其衍生物合成笛族