纈沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用

1、安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文分類號(hào)：密級(jí)：UDC：編號(hào)：學(xué) 位 論 文纈沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用Inhibitory effect of Valsartan on the endoplasmic reticulum stress and inflammation in the kidney of diabetic ratsXXX指導(dǎo)教師姓名 xxx 副教授申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱內(nèi)科學(xué)（腎?。?提交論文日期2015-03論文答辯日期2015-05學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué) 2015-07 答辯委員會(huì)主席評(píng) 閱 人2015 年 月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人所呈交的論文是我個(gè)

2、人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：日 期： 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解安徽醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版，有權(quán)允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。愿意將本人的學(xué)位論文提交中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫和中國(guó)學(xué)位論文

3、全文數(shù)據(jù)庫中全文發(fā)表，并可以以電子、網(wǎng)絡(luò)及其他數(shù)字媒體形式公開出版，并同意編入CNKI中國(guó)知識(shí)資源總庫，在中國(guó)博碩士學(xué)位論文評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫中使用和在互聯(lián)網(wǎng)上傳播。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。 學(xué)位論文作者簽名： 導(dǎo)師簽名：  日期： 日期：目 錄中英文縮略詞表2中文摘要3英文摘要5前言8材料和方法11結(jié)果20討論27結(jié)論35參考文獻(xiàn)36綜述及參考文獻(xiàn)41中英文縮略語表縮寫 英文名稱 中文名稱DN diabetic nephropathy 糖尿病腎病ERS endoplasmic reticulum stress 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR unfolded protein reaction

4、未折疊蛋白反應(yīng)IRE1 inositol requiring kinase-1 肌醇依賴酶1PERK protein kinase-like ER kinase 雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶ATF6 Aetivating Transeription Faetor6 活化轉(zhuǎn)錄因子6ERAD ER-associated degradation 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解途徑GRP78 glueose-regulatedProtein78 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78JNK c-Jun NHZ tenninal kinases c-Jun氨基末端激酶MCP-1 Monocyte chemotactic pro

5、tein-1 單核細(xì)胞趨化蛋白-1NF-B Nuclear factor-B 核因子 BSTZ Streptozotoein StrePtozocin 鏈脲佐菌素XBP-1 X-box binding protein l X盒結(jié)合蛋-1ROS reactive oxygen species 活性氧簇TRAF2 tumor neerosis factor receptor assoeiated faetor2 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2ESRD End-stage renal disease 終末期腎臟病ACEI Angiotensin-converting enzyme inhibitor 血

6、管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑ARB Angiotensin receptor blocker 血管緊張素受體抑制劑纈沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用中 文 摘 要目的 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，同時(shí)也是糖尿病患者死亡的一個(gè)主要原因，其發(fā)病率一直呈逐年升高趨勢(shì)，目前已成為我國(guó)導(dǎo)致終末期腎病的第二大因素。近年的研究認(rèn)為，DN是一種慢性炎癥性疾病，但其炎癥反應(yīng)發(fā)生的原因尚未明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）已被證實(shí)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可能在DN的炎癥反應(yīng)中起到一定作用。本研究擬通過構(gòu)建

7、糖尿病大鼠模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)炎癥反應(yīng)在糖尿病大鼠腎臟損害中的作用及血管緊張素受體拮抗劑纈沙坦對(duì)DN大鼠腎臟中ERS及相關(guān)炎癥的影響。 方法 34只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組，n=10只）、模型組（DM組，n=12只）、纈沙坦治療組（DM+V組，n=12只）。DM組、DM+V組大鼠腹腔注射STZ40mg/kg，制作糖尿病模型，各組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，DM+V組每天用纈沙坦灌胃6周（10 mg/kg），Con組及DM組只灌等量蒸餾水，共6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量大鼠體重、雙側(cè)腎臟重量，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)ERS標(biāo)志蛋白GRP78及中性粒細(xì)胞趨化因子1（MCP-1）的蛋白表達(dá)及定位，W

8、estern blot方法檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白P-IRE1、JNK、P-JNK、NF-B p65、P-NF-B p65蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)腎組織中JNK、NF-B 及炎癥因子MCP-1、TNF、IL-1mRNA表達(dá)變化，同時(shí)觀察各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、血漿白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等指標(biāo)的變化。 結(jié)果 1、與Con組相比，DM組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、BUN、Scr水平明顯升高（P<0.05），ALB明顯降低（P<0.05），與DM組相比，DM+V組24小時(shí)尿蛋白定量、BUN明顯降低（P<0.05），ALB明顯升高

9、（P<0.05），Scr較DM組降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；2、HE染色光鏡下Con組腎組織未見明顯病理改變，DM組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖肥大，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)聚積,腎小球基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞廣泛空泡變性，并可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，DM+V組與DM組相比，系膜細(xì)胞增殖肥大、系膜基質(zhì)聚積、腎小管上皮細(xì)胞廣泛空泡變性均減輕；3、免疫組化顯示Con組GRP78輕度表達(dá)、MCP-1幾乎無表達(dá)，與Con組相比，DM組GRP78、MCP-1表達(dá)明顯升高（P<0.05），且腎小管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與DM組相比，DM+V組GRP78、MCP-1表達(dá)明顯降低（P<0.05）；4、W

10、estern blot方法顯示，與Con組相比，DM組P-IRE1、P-JNK、P-NF-B p65蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），與DM組相比，DM+V組P-IRE1、P-JNK、P-NF-B p65蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），且P-JNK、P-NF-B p65與P-IRE1蛋白表達(dá)程度呈正相關(guān)（P<0.05）；5、qRT-PCR方法顯示：與Con組相比，DM組MCP-1、IL-1、NF-B p65、TNFmRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05），與DM組相比，DM+V組MCP-1、IL-1、NF-B p65、TNFmRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05

11、），3組間JNKmRNA表達(dá)變化無明顯差異（P0.05）。結(jié)論 1、DN中存在ERS的激活，活化的膜蛋白P-IRE1通過激活JNK及NF-B炎癥信號(hào)通路引起炎癥反應(yīng)；2、與NF-B通路相比，JNK通路的激活可能更易受ERS的影響，ERS對(duì)JNK的激活占主導(dǎo)地位；3、纈沙坦可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白IRE1介導(dǎo)的JNK及NK-B信號(hào)通路起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。 關(guān)鍵詞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 炎癥反應(yīng) 糖尿病腎病 纈沙坦Inhibitory effect of Valsartan on the endoplasmic reticulum stress and inflammation in the kidne

12、y of diabetic ratsAbstractObjective：Diabetic nephropathy ( DN) as one of the most serious microvascular complications in diabetes has become the second factor leading to end-stage renal disease at present，and its incidence is rising year by year. In recent years, the view that DN is a chronic inflam

13、matory disease has been recognized widely. But the cause of the inflammation reaction is not clear. Endoplasmic reticulum stress (endoplasmic reticulum stress, ERS) has been proved to be associated with inflammation closely, and may play a role in inflammation of the DN. In this experiment，we built

14、the diabetic rats model to study the role of endoplasmic reticulum stress and related inflammation in kidney damaged diabetic nephropathy rats and the effect of Valsartan .Methods：Among 34 healthy male SD rats，they were randomly divided into control group (Con group, n = 10), model group (DM group,

15、n = 12) and valsartan treatment group (DM + V group, n = 12). The rats of DM group and the DM + V group were intraperitoneally injected STZ（40mg/kg）for diabetes animal model. Valsartan(10mg/kg)was administered daily by gavage from the next day of the induction to diabetes for 6 weeks. The rats of DM

16、 + V group were intragastrically administered with valsartan (10 mg/kg) every day, while Con and DM group were only given the equivalent distilled water for 6 weeks.After the experiment, the weight of the rats and kidney were measured.The expression and distribution of ERS related protein GRP78 and

17、Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) was examined by immunohistochemistry,The expression of ERS related protein P-IRE1,P-JNK,JNK, NF-B p65,P-NF-B p65was examined by Western blot. Realtime fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expressions of JNK，NF-B and MCP-1，TNF，IL-1. 24 hour u

18、rine protein excretion, plasma albumin，Scr,BUN were checked，meanwhile.Results: 1, compared with Con group, 24 hours urinary protein quantitative, BUN, Scr of DM group rats increased significantly (P < 0.05), ALB decreased (P < 0.05), compared with DM group, 24 hours urinary protein quantitativ

19、e, BUN of DM + V group decreased significantly (P < 0.05), ALB increased significantly (P < 0.05), Scr reduced in the DM group without statistical significance (P > 0.05); 2, Glomerular and tubular in Con group had no significant changes,in the DM group,we found that glomerular extracellula

20、r matrix hyperplasia,mesangial matrix markedly increased, basement membrane thicken, mesangium gap widened, renal tubular epithelial vacuoles degeneration with partial stove atrophy, mild interstitial edema, glomerular and interstitial inflammatory cell infiltration. compared with DM group, DM + V g

21、roup appeared the reduction of mesangial cell proliferation, renal tubular epithelial vacuoles degeneration; 3, immunohistochemical appeared that GRP78 expressed mildly, MCP - 1 almost was no expression in the Con group, compared with Con group, the expression of MCP-1 increased significantly (P <

22、; 0.05), and strong positive expression in renal tubular epithelial cells. compared with DM group, DM + V group appeared that expression of GRP78, MCP-1 decreased significantly (P < 0.05); 4 ,Western blot method showed that compared with Con group, the expression of P-IRE1、P-JNK、P-NF-B p65 increa

23、sed significantly in DM group (P < 0.05), compared with DM group, expression of P-IRE1、P-JNK、P-NF-B p65 significantly decreased in DM + V group (P < 0.05), and expression of P-IRE1、P-JNK、P-NF-B p65 were positively correlated (P < 0.05);qRT - PCR shows that: compared with Con group, the mRNA

24、 expression of MCP-1、IL-1、NF-B p65、TNF increased significantly in DM group (P < 0.05), compared with DM group, the mRNA expression of MCP-1、IL-1、NF-B p65、TNF decreased significantly in DM group (P < 0.05), While there is no significant difference in the expression of JNK mRNA and protion among

25、 three groups (P > 0.05).Conclusion: 1, ERS and related inflammation was activated in the kidney of DM rats, and the activative membrane protein P-IRE1 caused inflammation by activating JNK and NF-B inflammatory signaling pathways ; 2, compared with the NF-B pathway, the activation of JNK pathway

26、 may be more sensitive to the effects of ERS, ERS activate JNK pathway dominantly. 3, Inhibition of the JNK and NF-B signaling pathway and related inflammation might be responsible for the renal protection effects of Valsartan.Keywords: endoplasmic reticulum stress/ inflammatory response /diabetic n

27、ephropathy / valsartan纈沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用1 前 言糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，同時(shí)也是糖尿病患者死亡的一個(gè)主要原因，進(jìn)入大量蛋白尿期以后，治療相當(dāng)困難，腎功能損害進(jìn)展迅速，一般5-10年即可進(jìn)入終末期腎衰竭1。2012年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟公布，全世界糖尿病患者已超過3710萬2。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)糖尿病患者，10-20年后蛋白尿發(fā)生率竟高達(dá)47.66%1。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全明確，給臨床治療帶來了很大困難，因此，探討DN的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病

28、的發(fā)病機(jī)制可概括為：蛋白激酶C（PKC）、氧化應(yīng)激（ROS）、細(xì)胞因子、遺傳分子以及炎癥學(xué)說。其中炎癥學(xué)說倍受關(guān)注，并認(rèn)為微炎癥反應(yīng)和隨后的細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張是上述其它機(jī)制在糖尿病腎病進(jìn)展中的共同途徑，炎癥在糖尿病腎病的進(jìn)展中發(fā)揮著核心作用3。糖尿病患者腎臟中的高糖環(huán)境及糖基化終末產(chǎn)物都是強(qiáng)烈的炎癥趨化因子刺激物，這些趨化因子包括白介素-8（CXCL8）、INF-趨化蛋白（CXCL10）、中性粒細(xì)胞趨化因子1（MCP-1）。這些趨化因子會(huì)招募巨噬細(xì)胞到腎臟，同時(shí)巨噬細(xì)胞直接分泌TNF-、IL-1、IL-6、活性氧（ROS）、血纖維蛋白溶解酶原催化因子1（PAI-1）、金屬蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TG

29、F-）、血管緊張素II和內(nèi)皮素等細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)4,引起炎癥反應(yīng)的循環(huán)，促進(jìn)腎小球硬化5。但是多年以來，DN中的炎癥反應(yīng)是如何被激活的，一直困擾著人們。直到2006年，Hotamisligill6第一次提出了代謝性炎癥(metaflammation)的概念，為闡釋DN的發(fā)病機(jī)制及其與免疫和炎癥的關(guān)系開啟了一個(gè)全新的思路。同時(shí)對(duì)代謝性炎癥的特點(diǎn)進(jìn)行了描述。DN中的炎癥也屬于代謝性炎癥(metaflammation)的范疇，與傳統(tǒng)經(jīng)典意義上的炎癥反應(yīng)不同，它不是由病原菌引起的而是由攝入過多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝過度負(fù)擔(dān)導(dǎo)致的低水平的慢性不典型炎癥，無紅腫熱痛等表現(xiàn)。然而，糖尿病腎病免疫炎癥代償性活化的

30、具體機(jī)制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)現(xiàn)恰當(dāng)?shù)亟忉屃搜装Y激活的具體途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)( endoplasmic reticulum， ER)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊、修飾、降解分泌及貯存Ca2+的場(chǎng)所，對(duì)外環(huán)境刺激非常敏感。不同的病理及生理的刺激，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過剩、感染、酸中毒、高同型半胱氨酸、氧自由基、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放劑及抑制劑、重金屬、蛋白糖基化與折疊抑制劑等，都會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)正常蛋白的折疊或?qū)е洛e(cuò)誤折疊蛋白的聚積，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這種功能異常的狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）7。未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的聚積將會(huì)誘

31、導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)造成損傷。于是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)答未折疊蛋白的積累，包括調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和分泌蛋白產(chǎn)生的能力8、上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白表達(dá)、促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ER-associated degradation，ERAD)途徑的激活等9，這種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制在1988年被命名為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），適度的ERS可以恢復(fù)ER及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞活性，但當(dāng)外界刺激因素持續(xù)存在時(shí)，過強(qiáng)或過長(zhǎng)時(shí)間的ERS將最終導(dǎo)致細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及凋亡10。ERS能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白來啟動(dòng)URP誘導(dǎo)凋亡，這三種蛋白分別是肌醇依賴酶1（i

32、nositol requiring kinase-1，IRE1）、雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶-樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase，PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子 6(activating transcription factor-6，ATF6)。其中IRE1與炎癥信號(hào)激活關(guān)系最為密切，體外研究中發(fā)現(xiàn)，活化的IRE1可以誘導(dǎo)NF-B及JNK通路的激活，從而引起相關(guān)炎癥反應(yīng)。既往的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是多種代謝性疾病如慢性心腦血管疾病、神經(jīng)性病變、胰島素抵抗、糖尿病、肥胖、脂肪肝等發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)11-12

33、，同時(shí)ERS還具有分子信號(hào)整合器的功能，可以同炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)合成降解等多種信號(hào)通路相偶聯(lián)13。糖尿病腎病屬于代謝性疾病的范疇，近年來已有部分研究證實(shí)糖尿病腎病中存在ERS的激活，但以往的研究局限于固有細(xì)胞凋亡的研究，對(duì)于DN中ERS與炎癥反應(yīng)的關(guān)系研究較少。本研究擬通過對(duì)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），建立糖尿病大鼠模型，觀察大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白、及腎臟組織病理變化確認(rèn)DN模型建立成功，同時(shí)觀察ERS激活的標(biāo)志性蛋白GRP78、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白IRE1的表達(dá)變化，驗(yàn)證DN中ERS狀態(tài)的存在，觀察NF-B及JNK介導(dǎo)的炎癥通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討DN中ERS與炎癥反應(yīng)

34、的關(guān)系。關(guān)于DN的治療，已有學(xué)者針對(duì)炎癥反應(yīng)機(jī)制對(duì)DN進(jìn)行了嘗試性治療。如糖尿病腎病患者服用免疫抑制劑雷公藤多苷后，其尿蛋白量可明顯減少。進(jìn)一步肯定了針對(duì)炎癥反應(yīng)機(jī)制在臨床實(shí)踐中治療糖尿病腎病的臨床意義。但是雷公藤性腺抑制等副作用限制了其應(yīng)用。免疫抑制劑治療DN的安全性目前仍飽受爭(zhēng)議。血管緊張素受體拮抗劑類藥物(angiotension lI receptor blocker，ARB)，是臨床治療DN應(yīng)用廣泛、較為安全的藥物，對(duì)糖尿病腎病特別是微量蛋白尿階段的治療有明顯的效果。有趣的是，越來越多的研究表明，ARB類藥物具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。研究表明，纈沙坦14具有降低CRP、IL- 6 等炎

35、癥因子的作用，然而其作用機(jī)制尚未完全明了。本研究從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的角度，應(yīng)用纈沙坦對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，觀察纈沙坦對(duì)早期糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、IRE1、NF-B、JNK及其下游炎癥因子表達(dá)的影響，探討其抑制炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制。為靶向性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑應(yīng)用臨床治療糖尿病腎病提供理論基礎(chǔ)。 2材料和方法2.1 材料和試劑2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠34只，體重190-210g，購(gòu)自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（京）2011-0011】。動(dòng)物房室溫控制在18-28，同時(shí)保持12小時(shí)晝夜循環(huán)，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。2.1.2主要試劑（1）10%水合氯

36、醛：北京軍區(qū)總醫(yī)院（2）4中性甲醛：北京化工廠（3）鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：美國(guó)Sigma公司（4）纈沙坦：北京諾華制藥有限公司（5）PMSF：美國(guó)Sigma公司（6）脫脂奶粉：華興博創(chuàng)公司（7）BCA蛋白定量試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司（8）ECL顯影劑：普利萊公司（9）DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋公司（10）SP超敏試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司（11）兔抗鼠P-IRE1抗體，兔抗鼠P-JNK抗體，兔抗鼠P-NF-B p65抗體：美國(guó)Abcam公司（12）兔抗鼠GRP78抗體，兔抗鼠JNK抗體，兔抗鼠NF-B p65抗體：美國(guó)Santa Cruz公司（1

37、3）兔抗鼠MCP-1抗體：北京博奧森公司（14）羊抗小鼠二抗，羊抗兔二抗，小鼠抗GAPDH單抗：北京中杉金橋公司（15）Trizol試劑盒：美國(guó)Invitrogen公司（16）RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：北京天根生化科技有限公司2.1.3主要儀器及耗材（1）精確天平：(上海第二天平儀器廠) （2）低溫離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司 （3）恒溫磁力攪拌棒：上海司樂儀器有限公司 （4）電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠 （5）恒溫?fù)u床：北京白鴿醫(yī)療儀器廠 （6）電泳儀：Bio-Rad公司 （7）轉(zhuǎn)膜儀：Bio-Rad公司 （8）簡(jiǎn)易血糖儀及試紙：美國(guó)羅氏公司 （9）圖像掃描儀：Canon公司 （10）相差倒

38、置顯微鏡：德國(guó)Leica公司 （11）生物組織包埋機(jī)：TB-718湖北泰維醫(yī)療科技有限公司 （12） 烤片機(jī)：德國(guó)Leica公司（13）石蠟切片機(jī)：德國(guó)Leica公司（14）X光膠片：日本富士公司（15）硝酸纖維素膜：Millipore公司 （16）qRT-PCR儀（美國(guó)IBM公司）2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1模型制備及分組34只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組，n=10只）、模型組（DM組，n=12只）、纈沙坦治療組（DM+V組，n=12只）。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，DM組、DM+V組大鼠腹腔注射STZ（STZ 溶于10mmol/L 的檸檬酸鹽溶液，PH 為4.5，40mg/kg）制作

39、糖尿病模型，Con組只注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液，尾靜脈取血連續(xù)3天，測(cè)定空腹血糖16.7mmol/L，確定為糖尿病大鼠。對(duì)照組血糖46mmol/L 左右。所有大鼠試驗(yàn)期間不用外源性胰島素，避免胰島素干擾實(shí)驗(yàn)過程。DM+V組每天用纈沙坦灌胃6周（10 mg/kg），Con組及DM組只灌等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食。2.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本留取與檢測(cè)2.2.2.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)在給藥6周后處死全部大鼠，10%水合氯醛麻醉后，將大鼠置于鼠臺(tái)上，沿腹中線切開腹腔，找到下腔靜脈，直視下腔靜脈取血5ml。以3000rpm，4條件下離心10min，取血清送我院檢驗(yàn)科。檢測(cè)血肌酐、血尿素氮、血漿白蛋白

40、、血糖水平。2.2.2.2 24小時(shí)尿蛋白定量測(cè)定第6周處死前先用試紙條法行定性檢測(cè)，再分別將大鼠放入代謝籠中，采集24 h尿液, 檢測(cè)24 h尿蛋白定量。2.2.2.3 腎臟組織標(biāo)本留取開腹后直視下找到雙腎及腎周筋膜，予以剝離雙腎，止血鉗夾閉腎蒂切除雙側(cè)腎臟，放入PBS緩沖液中洗去殘留血跡并稱重，部分腎組織以10%甲醛固定用于免疫組化和腎臟病理檢測(cè)，其余組織切成小塊，迅速放入液氮中，再置于-80冰箱中凍存，用于western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。2.2.3 HE染色病理觀察 A修片：于10%甲醛溶液中取出組織塊，按照0.3cm3的標(biāo)準(zhǔn)切成小塊；B脫水：將組織塊依次放入75%酒精85%酒精9

41、5%酒精100%酒精100%酒精梯度脫水，各40min；C包埋：將組織塊浸入氯仿中40min透明，再侵入石蠟中2小時(shí)左右；D切片：用切片機(jī)連續(xù)切出厚度為2-3m薄片；E染色：將切好的片子依次置于：二甲苯二甲苯100% 酒精100%酒精95% 酒精90% 酒精80% 酒精70% 酒精(各15min) 蒸餾水沖洗；蘇木素染細(xì)胞核12min，流水洗3 min；放入1%鹽酸乙醇分化幾秒鐘，水洗；放入氨水中返藍(lán)幾秒鐘，水洗；F. 梯度酒精脫水：75% 酒精85% 酒精95% 酒精100% 酒精100% 酒精(各10min)；G二甲苯透化，中性樹膠封片；H用光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理改變；2.2.4 免疫組織

42、化學(xué)方法檢測(cè)腎臟組織GRP78和MCP-1的表達(dá)及定位A將組織片放置在附著多聚賴氨酸的載玻片上過夜，防止脫片；B二甲苯脫蠟：二甲苯(10min)二甲苯(10min)100%乙醇(10min)100%乙醇(10min)95%乙醇(5min)90%乙醇(5min)85%乙醇(5min)75%乙醇(5min)自來水沖洗PBS洗兩次；C取出片子擦干水漬，滴加1滴3%雙氧水,置于室溫15min,PBS沖洗2min×3次；D組織抗原熱修復(fù)：壓力鍋中加入pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液至沸騰，將切片浸入液面以下，加熱2.5min后，取出切片，冷卻至室溫后，PBS沖洗5min×4次；E加入1滴小

43、牛血清進(jìn)行封閉15min，室溫下靜置；F加入1滴一抗：分別滴加兔抗鼠GRP78抗體（1:75）、兔抗鼠NCP-1抗體(1:100)，4保濕盒內(nèi)過夜， PBS替代一抗做陰性對(duì)照，PBS洗5min×3次；G加入1滴辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫，濕度箱內(nèi)20min，PBS洗5min×3次；H加入聚合物輔助劑，再置于室溫20min，PBS洗5min×3次； I滴加1滴DAB顯色液，顯微鏡下觀察1-3分鐘；J自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1min 自來水沖洗 1%鹽酸乙醇浸潤(rùn)5秒自來水沖洗1%氨水浸5秒自來水沖洗 85%酒精90%酒精 95%酒精100%酒精自來水沖洗二甲苯

44、浸3min；K中性樹膠封固，通風(fēng)櫥內(nèi)24小時(shí)；L光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。2.2.5 Western blot檢測(cè)活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白P-IRE1及相關(guān)炎癥通路蛋白JNK、P-JNK、NF-B p65、P-NF-B p65 的蛋白表達(dá) 2.2.5.1 組織蛋白的提?。?）將0.2g腎組織塊用干凈剪刀盡量剪碎，置于勻漿器的球部，加入400 ml含有PMSF的RIPA 裂解液，進(jìn)行勻漿，置于冰上20min；（2）在冰上研磨冰浴5min后，放在冰上，反復(fù)幾次直到碾碎組織；（3）30 min后裂解完畢，將裂解液移至1.5ml離心管中，離心15min ，12000rpm，4，取上清分裝在0.5ml離心管中；

45、（4）取10µl進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，其余分裝入0.5ml離心管中，-70凍存。2.2.5.2 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度（1）取96孔板，外周一圈孔棄去不用，每個(gè)蛋白設(shè)置一個(gè)復(fù)孔，設(shè)置五個(gè)孔標(biāo)準(zhǔn)蛋白梯度，分別為750µg/ml，500µg/ml，250µg/ml，125µg/ml，62.5µg/ml；（2）配置BCA工作液：將A液B液按照50:1的比例配置所需量的BCA工作液，標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測(cè)蛋白每孔加入200µl；（3）將待測(cè)蛋白分別按1:50、1:100稀釋后，各取25µl加入到96孔板中；（4）將96孔板安放在恒溫水

46、浴箱中，37，2小時(shí)；（5）顯色后的96孔板安放在酶標(biāo)儀中，讀數(shù)。2.2.5.3 蛋白質(zhì)變性（1）配置2×SDS上樣緩沖液：20%SDS 2ml，溴酚藍(lán)0.5ml，1M DTT 1ml，甘油2ml，0.5M Tris pH 6.8 2ml，ddH2O 2.5ml；（2）蛋白樣品中加入等體積的上樣緩沖液，放入95的水浴鍋中煮沸5min，后放入-20冰箱保存；2.2.5.4 SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：（1）清洗玻璃板：用洗潔劑輕輕擦洗，玻璃板兩側(cè)均用自來水沖洗，再反復(fù)用反滲水沖洗，立位晾干；（2）灌制膠板:先裝好電泳槽及玻璃板，按下面表格（表1）配置10%的分離膠，

47、灌入分離膠后，立即用正丁醇封膠，約0.5-1h后分離膠凝固后，配置5%的濃縮膠，倒出正丁醇，灌入濃縮膠，立即插入點(diǎn)樣梳，置于4冰箱中過夜，次日拔出點(diǎn)樣梳； 表1.SDS-聚丙酰胺凝膠配方表組分10%分離膠組分5%濃縮膠30%丙烯酰胺5.0ml30%丙烯酰胺0.83ml1.5mol/LTris（PH8.8）3.8ml1mol/LTris（PH6.8）0.63ml10%過硫酰胺0.15ml10%過硫酰胺0.05ml10%SDS0.15ml10%SDS0.05mlTEMED0.006mlTEMED0.005mlH2O5.9mlH2O3.4ml總量15ml總量5ml（3）上樣：將做好的膠板放入電泳槽里

48、，導(dǎo)入甘氨酸電泳緩沖液，沒過梳子，輕輕垂直拔出點(diǎn)樣梳，將蛋白樣品按每孔50µg蛋白量的體積進(jìn)行上樣，保證每樣本蛋白上樣量相等，體積不等時(shí)用1×上樣緩沖液補(bǔ)齊，蛋白Maker每孔5ul，同樣用1×上樣緩沖液補(bǔ)齊；（4）電泳：首先給予恒定電壓60V，直到溴酚藍(lán)跑至分離膠，調(diào)整電壓為90V，直到溴酚藍(lán)剛剛跑出即終止電泳，轉(zhuǎn)膜。2.2.5.5 轉(zhuǎn)膜（1）帶手套，將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜切成與待轉(zhuǎn)凝膠同樣大小，同時(shí)準(zhǔn)備同樣大小的濾紙6張，一起置于轉(zhuǎn)膜液中；（2）卸下分離膠，按照以下順序排列夾層：由下到上依次是海綿墊、3張濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3張濾紙、海綿墊，注意放置每一

49、層時(shí)趕出每層氣泡；（3）將轉(zhuǎn)印夾放入轉(zhuǎn)移槽中，注意凝膠靠近陰極，硝酸纖維素膜靠近陽極。在轉(zhuǎn)移槽外放入冰塊降溫，調(diào)至恒流250 mA，150 min；（4）用1×麗春紅染液染膜5min（在脫色搖床搖動(dòng)）。然后用水洗去多余的染液，觀察膜上的蛋白，去離子水漂白條帶。 2.2.5.6封閉（1）用TBS配置出6%的脫脂牛奶10ml導(dǎo)入平皿中；（2）將轉(zhuǎn)好的蛋白膜置于平皿中，搖床搖1-2小時(shí)，然后4過夜；2.2.5.7免疫反應(yīng)及顯色 （1）封閉后的硝酸纖維素膜用TBS漂洗5min×3次；（2）用TBS稀釋一抗，滴度分別為：兔抗大鼠P-IRE1抗體（1：400）、兔抗大鼠P-JNK抗體（

50、1：200）、兔抗大鼠JNK抗體（1：250）、兔抗大鼠P-NF-B p65（1:500）、兔抗大鼠NF-B p65（1:800）、小鼠抗大鼠GAPDH抗體（1：3000），37孵育2h，然后4過夜；（3）TBS洗膜，5min×3次；（4）將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1:8000）或羊抗鼠抗體（1:5000）加入洗好的膜上, 37 孵育2h；（5）再用TBS漂洗5min×3次；（6）將ECL發(fā)光液、A液和B液等體積混合，將硝酸纖維素膜浸沒于 ECL 化學(xué)發(fā)光液中顯色 ，進(jìn)入暗室進(jìn)行曝光，曝光時(shí)間為1到5min；（7）用ImageJ分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定

51、量分析,確定雜交條帶的吸光度值。以目的蛋白條帶和內(nèi)參照GAPDH條帶吸光度值的比值表示各蛋白表達(dá)量；2.2.6 利用qRT-PCR檢測(cè)DM大鼠腎臟組織中JNK、NF-B p65及下游炎癥因子MCP-1、TNF、IL-1mRNA的變化 2.2.6.1提取組織總RNA（1）所有實(shí)驗(yàn)器具均經(jīng)RNase處理，從-80冰箱中取出凍存的大鼠腎組織（約100mg），置于研缽，加液氮研磨成粉末，加入Trizol試劑 1ml輕輕吹打，在轉(zhuǎn)移至2mlEP管中3-5min；（2）向EP管中加入0.2ml氯仿，上下顛倒震蕩混勻30秒，冰浴10-15min；（3）12000rpm離心，4，10min；（4）吸出上層含有

52、RNA的液體，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入相同體積的異丙醇，混勻，冰浴30min；（5）12000rpm 離心，4，15min，棄上清；（6）加入1ml 75% DEPC乙醇洗滌，再次12000rpm離心，4，15min，棄上清；（7）12000rpm離心，4，1min，吸出殘余液體；（8）開蓋，置于通風(fēng)櫥中，使乙醇自然揮發(fā)；（9）加入30µl DEPC水小心吹打溶解沉淀，取出一定溶解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，剩下溶液放回-80冰箱凍存。2.2.6.2逆轉(zhuǎn)錄（PT）反應(yīng)（1）將樣品稀釋50倍用紫外線分光光度計(jì)測(cè)濃度，計(jì)算RNA濃度；（2）用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板； 反應(yīng)體系：總體積

53、 20µl，其中 RNA 5µg，2×ES Reaction Mix 10µl，dT18 1µl，RIES Mix 1µl，補(bǔ)水至20µl。 反應(yīng)條件：42 延伸 35min，后轉(zhuǎn)為80 5min。 2.2.6.3 Real time PCR反應(yīng)（1）PCR所用引物序列（表2） 表2 所用引物序列基因引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度JNKF：5' - TGATGACGCCTTACGTGGTA -3'114bpR：5' - GGCAAACCATTTCTCCCATA -3'NF-B F: 5' - A

54、ATTTGGCTTCCTTTCTTGGCT -3'194bpR：5' - CTGCGATACCTTAATGACAGCG -3'MCP-1F: 5' - ACCTGCTGCTACTCATTCA -3'125bpR: 5' - GCTGCTGGTGATTCTCTTG -3'TNF-F: 5' - TACTGAACTTCGGGGTGATCG -3'204bpR：5' - TCCGCTTGGTGGTTTGCTAC -3'IL-1F: 5' - GACAAGCAACGACAAAATCCC -3'116

55、bpR：5' - GAAGACAAACCGCTTTTCCATC -3'GAPDHF: 5' - TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG -3'159bpR：5' - AGGTGGAAGAATGGGAGTTG -3'（2）反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積 20µl，其中 2×SYBR Premix Ex TaqTM II 10µl，DyeII 0.4µl,上游引物0.4µl，下游引物0.4µl，模板 cDNA 1µl，ddH2O 7.8ul 反應(yīng)條件：94 ，預(yù)變性10 min，Tag 酶活化，94 15 s， 60 60 s，45 個(gè)周期結(jié)束，反應(yīng)完成后于16 保存。（3）使用GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的