臨床遺傳學常用的生物信息

1、臨床遺傳學臨床遺傳學與生物信息學與生物信息學:工具與資源工具與資源劉春宇劉春宇主要內(nèi)容主要內(nèi)容 定定義與背景義與背景 主要數(shù)據(jù)對象及特點主要數(shù)據(jù)對象及特點 常用數(shù)據(jù)庫資源與工具常用數(shù)據(jù)庫資源與工具 臨床遺傳學實驗室的基本信息學裝備與管臨床遺傳學實驗室的基本信息學裝備與管理理 生生物信息學的基本技能物信息學的基本技能定義定義生物信息學生物信息學(Bioinformatics)是研究生物數(shù)據(jù)的采集、處理、存儲、傳播，分析和解釋等各方面的學科，是生命科學和計算機科學相結(jié)合形成的一門學科。是通吃所有現(xiàn)在與未來的OMICS的學科。生物信息學應(yīng)用服務(wù)于科研與臨床。精準醫(yī)學背景下的精準醫(yī)學背景下的遺傳學和生

2、物信息學遺傳學和生物信息學科研科研：基因定位、突變檢測、基因型分析、疾病易感基因的關(guān)聯(lián)分析、基因與蛋白的調(diào)控、結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測分析臨床臨床：突變檢測、基因型分析，和已知相關(guān)基因的信息查詢和臨床指導(dǎo)生物信息學是生物信息學是現(xiàn)代遺傳學研究的靈魂現(xiàn)代遺傳學研究的靈魂 遺傳學數(shù)據(jù)量大遺傳學數(shù)據(jù)量大 一個人攜帶數(shù)百萬的多態(tài)或突變 2萬余編碼蛋白的基因表達，數(shù)十萬甚至更多的剪接本，非編碼調(diào)控基因、分子 種類多種類多 SNVs, CNVs, INDELs, SVs 可遺傳的、新生的、體細胞的 影響編碼的，調(diào)控的 數(shù)據(jù)到知識的轉(zhuǎn)化依賴信息的分析與整合數(shù)據(jù)到知識的轉(zhuǎn)化依賴信息的分析與整合 知識到臨床實踐的轉(zhuǎn)化依賴

3、信息的管理與發(fā)布知識到臨床實踐的轉(zhuǎn)化依賴信息的管理與發(fā)布主要數(shù)據(jù)對象主要數(shù)據(jù)對象 遺傳學數(shù)據(jù)遺傳學數(shù)據(jù) 表型數(shù)據(jù)表型數(shù)據(jù)單基因病單基因病VS多基因病多基因病 ？突變與多態(tài)性突變與多態(tài)性 ？American College of Medical Genetics ACMG Minimum List (56 genes)Ambry Exon screen 293 genes for 229 diseases對臨床醫(yī)生最重要關(guān)鍵信息對臨床醫(yī)生最重要關(guān)鍵信息 DNA變異：變異： 區(qū)分致病突變、易感基因與常見多態(tài)區(qū)分致病突變、易感基因與常見多態(tài) 變異影響到的什么基因變異影響到的什么基因 基因名稱基因名稱

4、 功能功能 如果影響基因的功能如果影響基因的功能 蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì)編碼 表達量表達量信信息的有效性和適用范圍息的有效性和適用范圍 基因型與表型的關(guān)系基因型與表型的關(guān)系 可行動性（可行動性（Actionable）大合作大數(shù)據(jù)的重要性大合作大數(shù)據(jù)的重要性 基因型與表型的關(guān)系基因型與表型的關(guān)系 BRCA1 的突變?yōu)槔耐蛔優(yōu)槔?人群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)千種變異，致病性如何？人群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)千種變異，致病性如何？常用數(shù)據(jù)庫資源與工具常用數(shù)據(jù)庫資源與工具 基因組與序列基因組與序列 各類圖譜各類圖譜 序列序列 基因組與表觀基因組基因組與表觀基因組 變異與表型變異與表型 OMIM, GWAS catalogDNA變

5、異數(shù)據(jù)查詢變異數(shù)據(jù)查詢 UCSC genome browser （位置）（位置） /cgi-bin/hgTracks?clade=mammal&org=Human&db=hg19&position=BRAC1&hgt.positionInput=BRAC1&hgt.suggestTrack=knownGene&Submit=submit&hgsid=423900655_v4S6u9fIecnW2XqxxDOTaqapW1v3&pix=1045 NCBI ClinVar （變異與疾?。ㄗ儺?/p>

6、與疾?。?/clinvar/?term=PTEN%5Bgene%5D基因的相關(guān)信息基因的相關(guān)信息 GeneCards /cgi-bin/carddisp.pl?gene=BRCA1&search=aa389e880a9c80096d5a96c63a2975f6常見病的易感基因常見病的易感基因 GWAS Catalog /page.cfm?pageid=26525384#searchForm基因表達的信息基因表達的信息 BRCA1 http:/www.

7、/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BRCA1&search=aa389e880a9c80096d5a96c63a2975f6遺傳學以外的生物信息學遺傳學以外的生物信息學 臨床大數(shù)據(jù)臨床大數(shù)據(jù) 人口資人口資料料 影像學影像學 生理生化生理生化 病理病理 治治療與療效療與療效 生生物測量物測量 可穿戴設(shè)備可穿戴設(shè)備計算需求計算需求 100 TB PB存貯空間存貯空間 64 1000+ CPU 32 - 64+ G 內(nèi)存內(nèi)存 并行運算，流程化，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，備份并行運算，流程化，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，備份臨床遺傳學實驗室的臨床遺傳學實驗室的基本信息學裝備與管理基本

8、信息學裝備與管理 計算機一般以計算機一般以Linux操作系統(tǒng)為佳，配以較大操作系統(tǒng)為佳，配以較大容量內(nèi)存（容量內(nèi)存（16 GB以上）、硬盤存貯空間（以上）、硬盤存貯空間（4 TB以上），以及數(shù)據(jù)備份系統(tǒng)以上），以及數(shù)據(jù)備份系統(tǒng) 如需要處理原始如需要處理原始NGS數(shù)據(jù)，則應(yīng)需要高性能、數(shù)據(jù)，則應(yīng)需要高性能、上千上千CPU的并行計算機集群（的并行計算機集群（cluster）或網(wǎng)格）或網(wǎng)格(grid) 因分析處理的數(shù)據(jù)不同，會需要使用到以上提因分析處理的數(shù)據(jù)不同，會需要使用到以上提到的各類商業(yè)或非商業(yè)的軟件、數(shù)據(jù)庫。而這到的各類商業(yè)或非商業(yè)的軟件、數(shù)據(jù)庫。而這些軟硬件安裝、使用、維護，都需要計算機專

9、些軟硬件安裝、使用、維護，都需要計算機專業(yè)人員提供業(yè)人員提供生物信息學的基本技能生物信息學的基本技能 大規(guī)模數(shù)據(jù)格式變換、處理大規(guī)模數(shù)據(jù)格式變換、處理 常用數(shù)據(jù)庫、軟件的使用常用數(shù)據(jù)庫、軟件的使用 數(shù)數(shù)據(jù)庫管理與查詢據(jù)庫管理與查詢 基基本編程、計算本編程、計算小結(jié)小結(jié) 臨床遺傳學的研究和應(yīng)用建立在臨床遺傳學的研究和應(yīng)用建立在DNA測序及相測序及相關(guān)數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上關(guān)數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上 臨床遺傳學實驗室，尤其是分子遺傳為手段的臨床遺傳學實驗室，尤其是分子遺傳為手段的實驗室，離不開生物信息的技術(shù)支持，熟練掌實驗室，離不開生物信息的技術(shù)支持，熟練掌握數(shù)據(jù)分析方法、了解相關(guān)數(shù)據(jù)資源的專才是握數(shù)據(jù)分析方法、了

10、解相關(guān)數(shù)據(jù)資源的專才是臨床遺傳學實驗室的重要構(gòu)成臨床遺傳學實驗室的重要構(gòu)成 其他臨床遺傳學工作者也有必要對數(shù)據(jù)及分析其他臨床遺傳學工作者也有必要對數(shù)據(jù)及分析方法、工具、及資源有基本的了解方法、工具、及資源有基本的了解, 對數(shù)據(jù)分對數(shù)據(jù)分析過程中涉及的數(shù)據(jù)文件類型有所了解析過程中涉及的數(shù)據(jù)文件類型有所了解 生物信息學與大數(shù)據(jù)生物信息學與大數(shù)據(jù)分析流程分析流程 質(zhì)控質(zhì)控 序列比對，拼裝序列比對，拼裝 發(fā)現(xiàn)變異發(fā)現(xiàn)變異 變異注釋變異注釋基因定位基因定位 以家系或群體樣本，通過連鎖或關(guān)聯(lián)分析，以家系或群體樣本，通過連鎖或關(guān)聯(lián)分析，以統(tǒng)計概率判斷基因在基因組中位置以統(tǒng)計概率判斷基因在基因組中位置 數(shù)據(jù)分

11、析流程：數(shù)據(jù)分析流程： 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與控制、過濾數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與控制、過濾 確定基因型確定基因型 數(shù)據(jù)進一步過濾（按等位基因頻率等）數(shù)據(jù)進一步過濾（按等位基因頻率等） 群體結(jié)構(gòu)分析群體結(jié)構(gòu)分析 關(guān)聯(lián)或連鎖分析關(guān)聯(lián)或連鎖分析分析軟件分析軟件 大體分為大體分為： 連鎖分析連鎖分析 基于家系數(shù)據(jù)的參數(shù)連鎖（基于家系數(shù)據(jù)的參數(shù)連鎖（parametric）與非參數(shù)連鎖）與非參數(shù)連鎖（non-parametric）分析）分析 關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)分析 基于家系基于家系 基于群體正常基于群體正常-對照對照 也可分為單點分析和多點分析，還有數(shù)量性狀分析及基也可分為單點分析和多點分析，還有數(shù)量性狀分析及基因因-基因相互作

12、用分析等基因相互作用分析等 群體結(jié)構(gòu)（群體結(jié)構(gòu)（population structure）分析）分析針對針對全全基因組的基因型數(shù)據(jù)基因組的基因型數(shù)據(jù) 不少軟件兼有多種分析的功能不少軟件兼有多種分析的功能常用的常用的家系關(guān)系和基因型錯誤檢查軟件家系關(guān)系和基因型錯誤檢查軟件 Pedcheck PREST (Pedigree RElationship Statistical Test) Plink 可在全基因組型數(shù)據(jù)中檢查家系關(guān)系、孟德爾可在全基因組型數(shù)據(jù)中檢查家系關(guān)系、孟德爾遺傳錯誤及性別錯誤遺傳錯誤及性別錯誤Imputation軟件軟件 用于用于推測基因組中未分型的標記推測基因組中未分型的標記

13、Beagle IMPUTE MACH常用常用連鎖分析軟件連鎖分析軟件 LINKAGE/FASTLINK GeneHunter和和GeneHunter-Plus Merlin SOLAR Simwalk FBAT/PBAT 相關(guān)軟件的總結(jié)對比可參考：相關(guān)軟件的總結(jié)對比可參考： Dudbridge,F. A survey of current software for linkage analysis. Hum. Genomics 1, 63-65 (2003) /ssg/linkage/linkageanalysis全基因組關(guān)聯(lián)分析（全基因組關(guān)聯(lián)分析（

14、GWAS）軟件）軟件 Plink (/purcell/plink/ ) 最廣泛使用的軟件最廣泛使用的軟件 Golden Helix（http:/ & Variation Suite (SVS) 較為廣泛使用的商用全基因組關(guān)聯(lián)分析軟件較為廣泛使用的商用全基因組關(guān)聯(lián)分析軟件 Bioconductor 的的GWASTools (/packages/release/bioc/html/GWASTools.html) 支持大型支持大型GWAS數(shù)據(jù)和注釋的存儲，及數(shù)據(jù)和注釋的存儲，及GWAS數(shù)據(jù)

15、的清數(shù)據(jù)的清理和分析理和分析 GCTA （http:/ SNPEVG (/) 圖形化工具，提供圖形化工具，提供SNP影響效應(yīng)圖影響效應(yīng)圖、 GWAS 結(jié)果視圖結(jié)果視圖變異檢測變異檢測變異檢測變異檢測 DNA變異常見類型變異常見類型： 單核苷酸多態(tài)（單核苷酸多態(tài)（SNP）和短片段插入缺失（）和短片段插入缺失（Indel） 缺失（缺失（deletion） 插入（插入（insertion） 倒位（倒位（ inversion） 易位（易位（translocation） 拷貝數(shù)變異拷貝數(shù)變異 （CNV） DNA 測序是確定基因型的方法之一，更是在樣測序是確

16、定基因型的方法之一，更是在樣本基因組中發(fā)現(xiàn)新變異的終極手段本基因組中發(fā)現(xiàn)新變異的終極手段DNA測序分析測序分析 針對單個小擴增片段進行的針對單個小擴增片段進行的Sanger測序測序 全基因組或全外顯子組的第二代測序全基因組或全外顯子組的第二代測序(Next-generation sequencing, NGS) 第三代測序第三代測序 因目前暫未普及，應(yīng)用較少，在此不做分析討因目前暫未普及，應(yīng)用較少，在此不做分析討論論基于基于Sanger測序的數(shù)據(jù)分析測序的數(shù)據(jù)分析 測序儀提供的數(shù)據(jù)分析軟件測序儀提供的數(shù)據(jù)分析軟件，如：，如： ABI的的Sequencing Analysis Software

17、商業(yè)軟件商業(yè)軟件，處理原始測序數(shù)據(jù)處理原始測序數(shù)據(jù)trace 文件（或稱文件（或稱chromatogram）以識別變異）以識別變異，如：，如： DNASTAR的的Lasergene Gene Codes的的Sequencher Softgenetics的的Mutation Surveyor 免費軟件免費軟件，如：，如： Phred/Phrap/Consed/PolyPhred SNPdetectorDNASTAR http:/ 快速組裝比對序列片段快速組裝比對序列片段 用即時互動視圖和過濾工具用即時互動視圖和過濾工具檢測和分析檢測和分析SNP 可可直接訪問直接訪問dbSNP、COSMIC和和G

18、ERP數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 可大規(guī)模比較多個樣本間或可大規(guī)模比較多個樣本間或多個群體樣本之間的多個群體樣本之間的SNP，并鑒定并鑒定SNP對基因的影響程對基因的影響程度度 Lasergene 工具包工具包可分析可分析Sanger測序和測序和NGS數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可從多個可從多個/群體樣本群體樣本的的Sanger測序數(shù)據(jù)中鑒定和比較潛在的致病變異測序數(shù)據(jù)中鑒定和比較潛在的致病變異Softgenetics http:/ 工具包工具包MUTATION Surveyor 專門針對專門針對Sanger測測序的序列進行變異序的序列進行變異檢測檢測 可在可在15分鐘之內(nèi)分析由分鐘之內(nèi)分析由Applied Biosyste

19、ms Genetic Analyzers、MegaBACE 或或Beckman CEQ 電泳系統(tǒng)產(chǎn)生的電泳系統(tǒng)產(chǎn)生的高達高達2000個個Sanger測序文件測序文件，支持，支持多種格式多種格式 分析分析結(jié)果結(jié)果SNP、Indel和體細胞變異具有較高的準確性和和體細胞變異具有較高的準確性和靈敏度靈敏度 能自動下載能自動下載GenBank氨基酸序列，進行序列比對、氨基酸序列，進行序列比對、DNA甲基化檢測、多變區(qū)間的變異檢測、雜合甲基化檢測、多變區(qū)間的變異檢測、雜合Indel的分解的分解識別識別de-convolution（這是這是MUTATION Surveyor的主要特的主要特色和賣點色和賣點

20、）、線粒體）、線粒體DNA序列分析和定量、自定義變序列分析和定量、自定義變異編碼與報告等異編碼與報告等雜合性雜合性Indel檢測輸出圖例，圖中正向顯示一雜合性檢測輸出圖例，圖中正向顯示一雜合性TT缺失的缺失的de-convolution基于基于NGS的數(shù)據(jù)分析的數(shù)據(jù)分析 項目總體流程項目總體流程Pabinger S, et al. Briefings In Bioinformatics, 2013NGS數(shù)據(jù)分析基本流程數(shù)據(jù)分析基本流程NGS數(shù)據(jù)分析基本流程數(shù)據(jù)分析基本流程1. 原始原始下機下機數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成fastq格式格式2. 測序質(zhì)量評估，評估數(shù)據(jù)產(chǎn)量和質(zhì)量，并根據(jù)需測序質(zhì)量評估，評

21、估數(shù)據(jù)產(chǎn)量和質(zhì)量，并根據(jù)需要去除接頭污染和低質(zhì)量序列要去除接頭污染和低質(zhì)量序列，如：，如：FastQC可對可對Illumina和和ABI SOLiD測序序列質(zhì)量進行快測序序列質(zhì)量進行快速評估速評估FASTX-Toolkit和和Galaxy即可評估序列質(zhì)量，還可去除即可評估序列質(zhì)量，還可去除污染堿基和低質(zhì)量堿基并對序列進行質(zhì)量過濾污染堿基和低質(zhì)量堿基并對序列進行質(zhì)量過濾3. 將序列比對到參考基因組上將序列比對到參考基因組上，生成生成SAM或或BAM文文件件比對工具如：比對工具如：BWA，bowtie2，Illumina的的Hiseq Analysis Software ，SOAP等等FASTQ

22、格式格式FASTQ 文件示例，該文件包含一條序列：文件示例，該文件包含一條序列：SEQ_IDGATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT+!*(*+)%+)(%).1*-+*)*55CCFCCCCCCC65A FASTQ文件將每條序列用四行表示：文件將每條序列用四行表示：第一行第一行 以以“”打頭，后跟著序列打頭，后跟著序列ID，可加上序列描述（類似于，可加上序列描述（類似于FASTA文件的標題行）；文件的標題行）；第二行第二行 是序列內(nèi)容；是序列內(nèi)容；第三行第三行 以以+ 打頭，后面的序列打頭，后面的序列ID和描述可

23、有可無；和描述可有可無；第四行第四行 是第二行序列每個位點的質(zhì)量值，字符個數(shù)必須與第二行是第二行序列每個位點的質(zhì)量值，字符個數(shù)必須與第二行完全相同。完全相同。4. 變異檢測變異檢測運用運用 GATK/MuTect/VarScan/Atlas2 /Samtools /SVDetect /Polymutt等工具包，查找等工具包，查找 SNP和和 Indel、缺失、插入、倒位、易位、缺失、插入、倒位、易位、CNV等等實踐顯示，多種不同軟件共同識別的變異有更高實踐顯示，多種不同軟件共同識別的變異有更高的可靠性，因此有建議使用的可靠性，因此有建議使用consensus calls生成生成VCF（Vari

24、ant Call Format）文件）文件5. 變異注釋變異注釋運用運用 Annovar、SeattleAnnotation、GenomeTrax等工具對每一變異篩查等工具對每一變異篩查dbSNP、1000genomes、PolyPhen、SIFT、 ESP 、 HGMD、OMIM、KEGG Pathway、CNV、DGV等數(shù)據(jù)庫，評估表型或疾病等數(shù)據(jù)庫，評估表型或疾病風險風險VCF 格式格式#fileformat=VCFv4.0 #fileDate=20110705 #reference=1000GenomesPilot-NCBI37 #phasing=partial #INFO= #INF

25、O= #INFO= #INFO= #INFO= #INFO= #FILTER= #FILTER= #FORMAT= #FORMAT= #FORMAT= #FORMAT= #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3 2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,. 2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:G

26、Q:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3 Variant Call Format (VCF) 是用于存儲基因序列變異的特定文本文件格式，該格式是隨著是用于存儲基因序列變異的特定文本文件格式，該格式是隨著大規(guī)?；蚍中秃痛笠?guī)?；蚍中秃虳NA測序而出現(xiàn)的，如千人基因組計劃。它包含描述元數(shù)據(jù)的行，然后是數(shù)據(jù)測序而出現(xiàn)的，如千人基因組計劃。它包含描述元數(shù)據(jù)的行，然后是數(shù)據(jù)表頭行，后面的數(shù)據(jù)行每行包含基因組中一個位置的信息（如變異信息）。表頭行，后面的數(shù)據(jù)行每行包含基因組中一個位置的信息（如變異信息）。6. 變異篩選變異篩選 （舉例，并非唯一方案）（舉例

27、，并非唯一方案）找出患者共有而正常對照沒有的變異去除不影響功能的變異，如同義變異、基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)的變異，保留Missense, nonsense, splice site, frameshift, cds-indel等變異過濾正常人數(shù)據(jù)庫dbSNP, 1000 Genome Project, ESP, in-house數(shù)據(jù)庫，對蛋白功能影響的預(yù)測基因純和或復(fù)合雜合位點過濾正常人數(shù)據(jù)庫dbSNP,1000 Genome Project, ESP, in-house數(shù)據(jù)庫，如：去除高頻突變顯性顯性隱性隱性SNP和和indel變異檢測軟件變異檢測軟件GATK 針對外顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù)針對外

28、顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù) 檢測檢測SNP和和indel，基因分型，基因分型 少量樣本少量樣本/多個樣本的群體變異檢測均可多個樣本的群體變異檢測均可 較高靈敏度和準確性，目前應(yīng)用很廣較高靈敏度和準確性，目前應(yīng)用很廣MuTect 適于混雜的不純腫瘤樣本，檢測體細胞適于混雜的不純腫瘤樣本，檢測體細胞SNP 運用精密的統(tǒng)計模型，假陽性產(chǎn)運用精密的統(tǒng)計模型，假陽性產(chǎn)出率出率很低很低VarScan/VarScan2 適于靶向測序，外顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù)適于靶向測序，外顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù) 單個樣本單個樣本/多個樣本多個樣本(群體樣本，如體細胞變異群體樣本，如體細胞變異)共有或獨有的種系共有或獨有的

29、種系變異、雜合性丟失（變異、雜合性丟失（LOH）、腫瘤與正常腫瘤外顯子）、腫瘤與正常腫瘤外顯子-正常體細胞正常體細胞CNV VarScan2特別針對腫瘤外顯子測序檢測體細胞突變和特別針對腫瘤外顯子測序檢測體細胞突變和CNV GATK Best Practices （ /gatk/guide/best-practices） Atlas2 全外顯子測序的變異檢測綜合分析包全外顯子測序的變異檢測綜合分析包 采采用邏輯回歸模型和簡單啟發(fā)式過濾法用邏輯回歸模型和簡單啟發(fā)式過濾法 檢測出的檢測出的SNP和和Indel準確性高、靈敏度高準確性高、靈敏度

30、高 Ploymutt 檢測家系內(nèi)的檢測家系內(nèi)的SNP和點突變和點突變 能結(jié)合家系遺傳關(guān)系找出家系內(nèi)共有變異，給出每個能結(jié)合家系遺傳關(guān)系找出家系內(nèi)共有變異，給出每個變異的可信度變異的可信度, 并提供一些過濾功能并提供一些過濾功能 Samtools 針對外顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù)針對外顯子和全基因組重測序數(shù)據(jù) 包含一系列包含一系列工具分析處理工具分析處理序列比對結(jié)果序列比對結(jié)果 可可檢測檢測SNP和和Indel變異，其檢出的變異，其檢出的SNP準確性略高于準確性略高于GATK，但靈敏度稍低，但靈敏度稍低，Indel的準確性較低的準確性較低 Hiseq Analysis Software（HAS)

31、Illumina開發(fā)的針對開發(fā)的針對HiSeq測序儀系列和測序儀系列和MiSeq測序儀的測序儀的專用數(shù)據(jù)分析軟件專用數(shù)據(jù)分析軟件 對外顯子或全基因組測序數(shù)據(jù)進行快速比對并檢測突對外顯子或全基因組測序數(shù)據(jù)進行快速比對并檢測突變變 外顯子測序突變檢測，運用當前廣為使用的外顯子測序突變檢測，運用當前廣為使用的BWA+GATK突變檢測法檢測突變檢測法檢測SNP和和Indel 全基因組重測序突變檢測，運全基因組重測序突變檢測，運用用最新開發(fā)的最新開發(fā)的Isaac算法，算法，對大量數(shù)據(jù)進行快速高效地比對并檢測與疾病相關(guān)的對大量數(shù)據(jù)進行快速高效地比對并檢測與疾病相關(guān)的SNP和和Indel變異，其結(jié)果的靈敏性

32、與準確性與變異，其結(jié)果的靈敏性與準確性與BWA+GATK的結(jié)果相差不大，但運行效率比的結(jié)果相差不大，但運行效率比BWA+GATK快快5倍以上倍以上HAS的的Isaac運行效率與運行效率與BWA+GATK的比較，的比較，SNP和和indel（SNV）檢測的對比）檢測的對比（http:/ 商業(yè)軟件商業(yè)軟件 CLC Genomics Workbench Partek Genomics Suite Softgenetics NextGENe工具包工具包 Golden Helix只分析變異檢出后得到只分析變異檢出后得到VCF文件后的下游分析文件后的下游分析結(jié)構(gòu)變異（結(jié)構(gòu)變異（SV）檢測）檢測 針對全基因

33、組重測序數(shù)據(jù)，檢測插入、缺針對全基因組重測序數(shù)據(jù)，檢測插入、缺失、倒位、易位、失、倒位、易位、CNV等等 檢測方法檢測方法 基于序列對的異常匹配基于序列對的異常匹配 基于深度分析基于深度分析 基于序列剪接分析法基于序列剪接分析法（對測序片段長度依賴較高，應(yīng)用對測序片段長度依賴較高，應(yīng)用較少較少）SV檢測軟件檢測軟件 SVdetect 適于適于短片段（如短片段（如200bp)的的paired-end測序和長片測序和長片段段(如如2kb)的的mate-paired測序測序 運用窗口滑動法和聚類法運用窗口滑動法和聚類法分析分析異常比對序列異常比對序列 可檢測長片段插入、缺失、倒位、平衡易位和可檢測長

34、片段插入、缺失、倒位、平衡易位和非平衡易位、非平衡易位、CNV 能比較多個樣本的變異差異能比較多個樣本的變異差異 可輸出多種格式的結(jié)果，包括用可輸出多種格式的結(jié)果，包括用Circos圖形化圖形化瀏覽瀏覽SV的格式的格式 Breakdancer 適于適于短片段短片段paired-end測序測序 可檢測可檢測插入、缺失、倒位、染色體之間和染色插入、缺失、倒位、染色體之間和染色體內(nèi)的異位體內(nèi)的異位 GASVPro Breakpointer CLEVER Pindel SVMerge可比較并整合多個分析工具的可比較并整合多個分析工具的結(jié)果結(jié)果CNV檢測軟件檢測軟件 MrFAST/mrCaNaVaR 運

35、用特有的方法減少測序錯誤并可檢測運用特有的方法減少測序錯誤并可檢測SNP 準確性和靈敏度較高準確性和靈敏度較高 CNV-Seq 根據(jù)兩個樣本比對后的深度分布根據(jù)兩個樣本比對后的深度分布，運用泊松分布運用泊松分布模型計算模型計算CNV差異差異 用于用于比較疾病樣本與正常樣本的差異比較疾病樣本與正常樣本的差異，尤其適，尤其適于于腫瘤樣本的檢測腫瘤樣本的檢測 能較好地預(yù)測拷貝數(shù)個數(shù)，能較好地預(yù)測拷貝數(shù)個數(shù)，靈敏度較好，準確性靈敏度較好，準確性不及不及 mrCaNaVaR readDepth 預(yù)測斷裂點位置和拷貝數(shù)個數(shù)較好預(yù)測斷裂點位置和拷貝數(shù)個數(shù)較好 假陰性較低假陰性較低 EWT 較好地預(yù)測斷裂點位

36、置較好地預(yù)測斷裂點位置 假陰性和假陽性較低假陰性和假陽性較低 運行效率較高，消耗內(nèi)存較少運行效率較高，消耗內(nèi)存較少 CNVnator 假陰性較低假陰性較低 FREEC 假陽性較低假陽性較低 運行效率較高，消耗內(nèi)存較少運行效率較高，消耗內(nèi)存較少 SegSeq 假陽性較低假陽性較低Duan, J. et al，PloS ONE，2013變異檢測軟件總結(jié)變異檢測軟件總結(jié) (Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013) 實踐顯示，多種不同軟件共同識別的變異實踐顯示，多種不同軟件共同識別的變異有更高的可靠性有更高的可靠性Ref to: Jia P, Li F, X

37、ia J, Chen H, Ji H, et al. (2012) Consensus Rules in Variant Detection from Next-Generation Sequencing Data. PLoS ONE 7(6): e38470. doi:10.1371/journal.pone.0038470變異注釋變異注釋變異注釋變異注釋 幫助預(yù)測變異幫助預(yù)測變異的生物學功能或意義的生物學功能或意義 目前目前有一系列的工具軟件對常見的編碼改變的有一系列的工具軟件對常見的編碼改變的功能效應(yīng)進行預(yù)測功能效應(yīng)進行預(yù)測，實際應(yīng)用中，具體運用某實際應(yīng)用中，具體運用某個特定的軟件是可以

38、根據(jù)需要調(diào)整、優(yōu)化的個特定的軟件是可以根據(jù)需要調(diào)整、優(yōu)化的 非編碼改變的影響預(yù)測準確性還相對有限，通非編碼改變的影響預(yù)測準確性還相對有限，通過數(shù)量性狀定位或關(guān)聯(lián)分析的文獻數(shù)據(jù)過數(shù)量性狀定位或關(guān)聯(lián)分析的文獻數(shù)據(jù)來預(yù)測來預(yù)測是目前最為有效的方法是目前最為有效的方法常見變異注釋工具常見變異注釋工具 ANNOVAR SnpEff SeattleSeq Annotation SIFT PLOYPHEN SCAN數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 VAT Oncotator變異注釋工具比較變異注釋工具比較(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013) ANNOVAR（ http:/www

39、./annovar/） 較全面的功能注釋，廣為使用較全面的功能注釋，廣為使用 需在本地安裝注釋數(shù)據(jù)庫，如需在本地安裝注釋數(shù)據(jù)庫，如dbSNP、1000genomes、SIFT、DGV等，范圍很廣很靈活等，范圍很廣很靈活 可可基于基因基于基因注釋注釋、基于區(qū)間、基于區(qū)間注釋，還可注釋，還可過濾過濾 對于對于全外顯子測序或全基因組測序全外顯子測序或全基因組測序的的SNP和和indel，將，將產(chǎn)生產(chǎn)生Excel兼容的結(jié)果文件，包括基因兼容的結(jié)果文件，包括基因注釋、氨基酸置換預(yù)測評分、保守性預(yù)測評分、注釋、氨基酸置換預(yù)測評分、保守性預(yù)測評分、dbSNP ID

40、、千人基因組變異頻率、千人基因組變異頻率、NHLBI-ESP 6500 個外顯子測序變異頻率等個外顯子測序變異頻率等等等 SnpEff （ http:/） 高效的高效的SNP/MNP/Indel變異注釋及功能影響預(yù)變異注釋及功能影響預(yù)測工具包測工具包 與與GATK兼容兼容 運用運用SnpSift過濾和處理注釋文件過濾和處理注釋文件 現(xiàn)已整合到現(xiàn)已整合到Galaxy，支持在線注釋，也可在本，支持在線注釋，也可在本地以命令行形式運行地以命令行形式運行 SeattleSeq Annotation （ /SeattleSeqAnnotation13

41、7/） 可在線注釋，也可離線注釋可在線注釋，也可離線注釋 可接受多種輸入格式，如可接受多種輸入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、自定義格式、一行一基因型格式、自定義格式、一行一基因型格式、GATK BED 可可根據(jù)根據(jù)NCBI 全基因全基因注釋注釋、或、或CCDS（僅編碼區(qū)）、或（僅編碼區(qū)）、或NCBI和和CCDS兩者兼有兩者兼有 注釋注釋的結(jié)果的結(jié)果內(nèi)容內(nèi)容較較SnpEff豐富，但不及豐富，但不及ANNOVAR全面全面 SCAN數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 （ /newinterface/about.html） 大型大型SNP和和CNV注釋數(shù)據(jù)庫注釋數(shù)據(jù)庫

42、 結(jié)合結(jié)合eQTL表達數(shù)量性狀數(shù)據(jù)庫，可進行遺傳學和基因表達數(shù)量性狀數(shù)據(jù)庫，可進行遺傳學和基因組學數(shù)據(jù)的挖掘組學數(shù)據(jù)的挖掘 包含兩類包含兩類SNP注釋：注釋： SNP與基因的位置關(guān)系和連鎖不平衡（與基因的位置關(guān)系和連鎖不平衡（LD）關(guān)系）關(guān)系 結(jié)合結(jié)合eQTL表達數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)庫，根據(jù)對表達水平的影響程表達數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)庫，根據(jù)對表達水平的影響程度定義度定義SNP功能功能 可用于全基因組關(guān)聯(lián)分析（可用于全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）的下游分析，）的下游分析， 經(jīng)過經(jīng)過多步處理來多步處理來劃劃分分SNP或或CNV變異與疾病的關(guān)聯(lián)程度變異與疾病的關(guān)聯(lián)程度 VAT （http:/vat.gerstei

43、/index.php ） 采用云計算技術(shù)進行個人基因組變異的功能注采用云計算技術(shù)進行個人基因組變異的功能注釋釋 基于基于GENCODE 的注釋（轉(zhuǎn)錄因子的位置和序列）的注釋（轉(zhuǎn)錄因子的位置和序列）進行對轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)編碼的功能進行對轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)編碼的功能影響影響注釋注釋 Oncotator （/oncotator/） 針對腫瘤研究針對腫瘤研究，在線注釋在線注釋SNP和和Indel 注釋主要含三個方面注釋主要含三個方面： 基因組的基因、轉(zhuǎn)錄、功能影響（參考基因組的基因、轉(zhuǎn)錄、功能影響（參考UCSC KnownGenes

44、 hg19 和和 mirBase），），dbSNP的的SNP注釋（含千人基因組計劃）注釋（含千人基因組計劃） 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的UniProt、DrugBank和和PloyPhen-2注釋注釋 腫瘤相關(guān)注釋，如腫瘤相關(guān)注釋，如COSMIC的腫瘤變異頻率、的腫瘤變異頻率、Cancer Gene Census 的腫瘤基因和變異、的腫瘤基因和變異、Tumorscape 和和TCGA Copy Number Portal收錄的顯著片段擴增或缺失、收錄的顯著片段擴增或缺失、Cancer Cell Line Encyclopedia的的 Oncomap重疊變異、發(fā)表的重疊變異、發(fā)表的MutSig分析的重大分

45、析的重大變異基因注釋，變異基因注釋，F(xiàn)amilial Cancer 數(shù)據(jù)庫的腫瘤基因注釋、人類數(shù)據(jù)庫的腫瘤基因注釋、人類DNA修補基因注釋（修補基因注釋（Human DNA Repair Gene ）等）等變異檢測及注釋示例變異檢測及注釋示例示例一：示例一：從全外顯子測序結(jié)果檢測從全外顯子測序結(jié)果檢測SNP和和 Indel通過患者血漿連續(xù)采通過患者血漿連續(xù)采樣進行樣進行DNA測序來分析比較腫瘤治療的獲得抗性測序來分析比較腫瘤治療的獲得抗性1.全外顯子測序原始數(shù)據(jù)去除接頭并轉(zhuǎn)換成全外顯子測序原始數(shù)據(jù)去除接頭并轉(zhuǎn)換成fastq格式格式2.FastQC測序質(zhì)量評估，測序質(zhì)量評估，F(xiàn)astX/腳本腳本

46、去除低質(zhì)量的堿基去除低質(zhì)量的堿基或序列或序列3.BWA將每個樣的序列分別比對到參考基因組將每個樣的序列分別比對到參考基因組hg194.Picard去除去除PCR重復(fù)序列重復(fù)序列5.GATK進行局部比對，如基于進行局部比對，如基于dbSNP已知已知Indel重新進重新進行比對行比對6.GATK對堿基質(zhì)量重新計算，對堿基質(zhì)量重新計算，進行進行標準化標準化7.SAMtools將比對質(zhì)量將比對質(zhì)量60的正確比對序列生成的正確比對序列生成Pileup文件，并對文件，并對堿基堿基質(zhì)量質(zhì)量 30的的計算等位基因頻率計算等位基因頻率（AF)8.GATK根據(jù)特定規(guī)則檢測變異根據(jù)特定規(guī)則檢測變異9.ANNOVAR

47、注釋變異，對注釋變異，對P值值 0.05的變異進行進一步的變異進行進一步分析分析示例二：示例二：從全基因組重測序結(jié)果檢測從全基因組重測序結(jié)果檢測SV1.全外顯子測序原始數(shù)據(jù)去除接頭并轉(zhuǎn)換成全外顯子測序原始數(shù)據(jù)去除接頭并轉(zhuǎn)換成fastq格式格式2.測序質(zhì)量評估，并去除低質(zhì)量的堿基或序列測序質(zhì)量評估，并去除低質(zhì)量的堿基或序列3.BWA將序列比對到參考基因組將序列比對到參考基因組hg194.SAMtools去除去除PCR重復(fù)序列重復(fù)序列5.GATK進行局部進行局部重新重新比對，如基于已知比對，如基于已知Indel重新進行重新進行比對比對6.SVDetect分離出異常比對的序列并產(chǎn)生分離出異常比對的序

48、列并產(chǎn)生BAM文件文件7.SVDetect、Breakdancer等多個工具根據(jù)特定規(guī)則檢等多個工具根據(jù)特定規(guī)則檢測測SV8.SVMerge綜合比較多個工具的綜合比較多個工具的SV，調(diào)整斷裂點，過濾，調(diào)整斷裂點，過濾出高可信度的出高可信度的SV9.ANNOVAR注釋高質(zhì)量的注釋高質(zhì)量的SV，并過濾，并過濾DGV 、 CNV等數(shù)等數(shù)據(jù)庫的正常人據(jù)庫的正常人SV10.igvtools查看比對情況并檢驗變異查看比對情況并檢驗變異11.按按需要用需要用Circos環(huán)圖可視化瀏覽全基因組范圍的變異環(huán)圖可視化瀏覽全基因組范圍的變異 患者外周血患者外周血DNADNA的樣本，運用的樣本，運用Illumina

49、Hiseq2000Illumina Hiseq2000測序平測序平臺進行雙末端臺進行雙末端100bp X 2100bp X 2測序，對測序數(shù)據(jù)進行下列分析：測序，對測序數(shù)據(jù)進行下列分析：IGV顯示某染色體異位斷裂點的異常比對情況其它常用數(shù)據(jù)庫資源與工具其它常用數(shù)據(jù)庫資源與工具常用綜合數(shù)據(jù)庫常用綜合數(shù)據(jù)庫NCBI （ ）涵蓋最新的全面的生物信息相關(guān)資源，被廣為使涵蓋最新的全面的生物信息相關(guān)資源，被廣為使用用特別特別針對臨床遺傳研究，針對臨床遺傳研究，NCBI提供了一套專門的數(shù)據(jù)和工具，除支持一般的變異數(shù)據(jù)庫提供了一套專門的數(shù)據(jù)和工具，除支持一

50、般的變異數(shù)據(jù)庫dbSNP、dbVar、 dbGaP外，也有更專注于臨床研究的外，也有更專注于臨床研究的ClinVar、MedGen和和Genetic Testing Registry (GTR)UCSC （ / ）廣為使用的大型基因組圖譜瀏覽平臺，它大規(guī)模收錄了基因組參考序列和草圖廣為使用的大型基因組圖譜瀏覽平臺，它大規(guī)模收錄了基因組參考序列和草圖可可訪問訪問ENCODE和和Neandertal計劃計劃數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)EBI （ http:/www.ebi.ac.uk/ ）Medical and Clinical Genetics （http:/www.kum

51、/gec/prof/genewww.html）綜合了醫(yī)學和臨床遺傳學相關(guān)的研究信息和數(shù)據(jù)庫資源，包括與臨床信息相關(guān)的、生化綜合了醫(yī)學和臨床遺傳學相關(guān)的研究信息和數(shù)據(jù)庫資源，包括與臨床信息相關(guān)的、生化與分子遺傳相關(guān)的、腫瘤相關(guān)的、細胞遺傳、遺傳咨詢、基因組、神經(jīng)肌肉、產(chǎn)前診斷、與分子遺傳相關(guān)的、腫瘤相關(guān)的、細胞遺傳、遺傳咨詢、基因組、神經(jīng)肌肉、產(chǎn)前診斷、普及遺傳情況與出生缺陷、初級護理與管理保健醫(yī)療等等方面的資源鏈接普及遺傳情況與出生缺陷、初級護理與管理保健醫(yī)療等等方面的資源鏈接ENCODE (/ENCODE/ )ENCODE數(shù)據(jù)對于了解非編碼

52、區(qū)變異的功能效應(yīng)有重要價值數(shù)據(jù)對于了解非編碼區(qū)變異的功能效應(yīng)有重要價值人類基因組變異數(shù)據(jù)庫人類基因組變異數(shù)據(jù)庫 人類基因組突變數(shù)據(jù)庫（人類基因組突變數(shù)據(jù)庫（HGMD) 收錄收錄文獻文獻已報已報道道的與人類遺傳病相關(guān)的基因變異的與人類遺傳病相關(guān)的基因變異 dbSNP 收錄收錄SNP、indel、短片段的串聯(lián)重復(fù)和微衛(wèi)星序列、短片段的串聯(lián)重復(fù)和微衛(wèi)星序列 國際人類基因組單體型圖計劃國際人類基因組單體型圖計劃（HapMap） 目標目標：通過比較不同族群個體的基因組序列，檢測人類遺傳的相似性和通過比較不同族群個體的基因組序列，檢測人類遺傳的相似性和差異性，差異性， 可可查詢常見查詢常見SNP的頻率、的

53、頻率、SNP間連鎖不平衡關(guān)系，用于分析人群遺傳結(jié)構(gòu)，間連鎖不平衡關(guān)系，用于分析人群遺傳結(jié)構(gòu)，以及以及impute未測未測SNP 1000 Genome Project 25個民族的個民族的2500個人的基因組深度測序，構(gòu)建個人的基因組深度測序，構(gòu)建涉及低頻涉及低頻SNP的變化頻率、插入缺失、的變化頻率、插入缺失、CNV、結(jié)、結(jié)構(gòu)變化等方面的更精細的遺傳圖譜構(gòu)變化等方面的更精細的遺傳圖譜 人類結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)庫（人類結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)庫（DGV） （http:/dgv.tcag.ca/dgv/app/home） 收錄健康人收錄健康人基因組基因組上上鑒定的長度鑒定的長度50bp的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變異變異 Clin

54、ical Genomic Database（/CGD/ ） 專注于收集有專注于收集有臨床臨床干預(yù)的醫(yī)學遺傳學數(shù)據(jù)干預(yù)的醫(yī)學遺傳學數(shù)據(jù)，囊括已鑒定遺傳原因的所有囊括已鑒定遺傳原因的所有相關(guān)條件，每條記錄包括基因標識、疾病情況、等位基因、遺傳關(guān)系、相關(guān)條件，每條記錄包括基因標識、疾病情況、等位基因、遺傳關(guān)系、年齡、臨床分類、干預(yù)或原理等描述年齡、臨床分類、干預(yù)或原理等描述 只包括了單基因變異，而未包括遺傳關(guān)聯(lián)或多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病只包括了單基因變異，而未包括遺傳關(guān)聯(lián)或多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病 截至截至2013年年9月月13日，該數(shù)據(jù)庫收錄了日，該

55、數(shù)據(jù)庫收錄了2667個基因的相關(guān)臨床干預(yù)信息，個基因的相關(guān)臨床干預(yù)信息，涉及涉及19個不同的臨床表現(xiàn)分類和個不同的臨床表現(xiàn)分類和18個不同的臨床干預(yù)分類個不同的臨床干預(yù)分類 CARTAGENIA (http:/ 為遺傳研究實驗室和醫(yī)生提供診斷知識、為遺傳研究實驗室和醫(yī)生提供診斷知識、系統(tǒng)系統(tǒng)和服務(wù)，以幫助和服務(wù)，以幫助其其有效地有效地進行臨床相關(guān)的遺傳分析，也可為患者和監(jiān)護人提供遺傳咨詢進行臨床相關(guān)的遺傳分析，也可為患者和監(jiān)護人提供遺傳咨詢 其其Cartagenia BENCH是是基于網(wǎng)頁的工具和數(shù)據(jù)庫平臺，基于網(wǎng)頁的工具和數(shù)據(jù)庫平臺，幫助幫助解釋常規(guī)診斷解釋常規(guī)診斷中的基因變異，其中中的基因

56、變異，其中： BENCH lab工具包整合了臨床資源，可進行針對工具包整合了臨床資源，可進行針對NGS和和CNV的變異注釋和篩選的變異注釋和篩選 BENCH clinic支持在線電子分析申請、進行智能過濾和評分，并調(diào)整基因型支持在線電子分析申請、進行智能過濾和評分，并調(diào)整基因型-表表型的匹配，還可訪問擴展的病人樣本數(shù)據(jù)庫型的匹配，還可訪問擴展的病人樣本數(shù)據(jù)庫 BENCH consortium提供遺傳變異關(guān)聯(lián)圖并確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)、完整性和兼容性提供遺傳變異關(guān)聯(lián)圖并確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)、完整性和兼容性基因組圖形化瀏覽工具基因組圖形化瀏覽工具 Integrated Genomics Viewer (IGV) （/software/igv/home ） 瀏覽大瀏覽大型型基因組數(shù)據(jù)的高性能交互式視圖基因組數(shù)據(jù)的高性能交互式視圖 整合了整合了NCBI