第四章電泳技術(shù)PPT課件

1、 1 電泳：帶電粒子在電場中向著與其本身電荷相反的電極移動的過程。 2 電泳技術(shù)優(yōu)點：快速、準確、重現(xiàn)性好 3 電泳方法分類 按電場分：常壓（500V，適用小分子） 支持體分：自由電泳、區(qū)帶電泳 儀器裝置分：水平式、垂直式、懸架式 4 電泳條件：水溶液（緩沖液）、支持物（區(qū)帶電泳）、電場（電泳儀、電泳槽）第1頁/共21頁一 電泳的基本原理 電泳分離： 移動方向：帶電性質(zhì)決定 泳動度：帶電顆粒在單位電場強度下的移動速度。 v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影響的因素： 1顆粒本身：帶電、大小、形狀 2 外界因素：電場強度E、pH、離子強度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。第2頁/共21

2、頁二 紙電泳 以濾紙為支持體的電泳技術(shù) 操作要點： 1 選擇緩沖液 對顯色劑和紫外光吸收等觀察區(qū)帶的方法無影響 A 分離蛋白質(zhì)，pI 5，選pH8.6的緩沖液（巴比妥緩沖液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B 分離氨基酸：鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸醋酸，pH5.9 C 分離核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，檸檬酸pH23 D 分離糖類：HAC-NaAC, pH35第3頁/共21頁 2 濾紙的選擇與處理 層析用濾紙，紙寬23cm/樣品組分，長短影響電場強度。 3 點樣 點圓點（量少）、點條狀（一般），點中間（未知樣品）、點一邊（已知樣品） 干法、濕法 4 電泳 電橋水平、加蓋、電壓穩(wěn)定、注意時間

3、 5 顯色及分析 蛋白：溴酚蘭、氨黑10B、偶氮胭脂紅B Aa：茚三酮、靛紅 核酸：紫外光下觀察 一般洗脫定量第4頁/共21頁三 薄膜電泳 支持體：薄膜 優(yōu)點：分辨力較高、簡便、快速、區(qū)帶清晰、易于定量、便于保存 廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析 操作 1 薄膜的處理與放置 2 點樣 平衡 3 電泳：E 1025V/cm，0.52h 4 顯色第5頁/共21頁四 薄層電泳 將支持物與緩沖液調(diào)制成適當厚度的薄層進行電泳。 常用支持物：淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等 操作： 1 緩沖液選擇 離子強度較高的緩沖液 2 支持物處理 精制品 3 薄層板制作 4加樣：挖溝、混合樣品、填埋 5 電泳 6分析

4、：印染法第6頁/共21頁五 凝膠電泳 支持物：多孔凝膠 聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等 具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高 最常用聚丙烯酰胺凝膠，原因： 機械強度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。 分類：垂直管型盤狀電泳、垂直板型電泳； 連續(xù)、不連續(xù)、梯度、SDS凝膠電泳第7頁/共21頁第8頁/共21頁第9頁/共21頁 1 聚丙烯酰胺凝膠的制備 丙稀酰胺（單體）N,N-甲叉雙丙稀酰胺（交聯(lián)劑）（催化劑） 聚合 催化劑： （1）過硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黃素（VitB2）光 改變單體濃度可改變凝膠孔徑 交聯(lián)劑對孔徑有影響：5最小 根據(jù)要分離物質(zhì)的

5、相對分子質(zhì)量選擇合適的單體濃度。第10頁/共21頁 2 不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理 不連續(xù)電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠，用不同pH值的緩沖液： 樣品膠：大孔徑，pH6.76.8Tris-HCl緩沖液 濃縮膠：與樣品膠相同 分離膠：小孔徑，pH8.88.9 Tris-HCl緩沖液第11頁/共21頁 樣品壓縮成層原理： 電極緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸 HCl (解離） Cl ， Cl 泳動速度最快（快離子） CH2(NH2)COOH (樣品膠、濃縮膠pH6.76.8） CH2(NH2)COO（0.11.0）泳動速度最慢（慢離子） 蛋白質(zhì)（P）泳動速度介于快慢離子之間 電泳時， Cl

6、超過P走在最前面，其后形成一個離子濃度較低的低電導區(qū)較高電位梯度P和慢離子加速移動P壓縮成層 樣品進入分離膠后，pH為9.5（電泳過程實測）， CH2(NH2)COO增加，泳動速度增大，很快超過P， P在均一的電位梯度和pH條件下分離第12頁/共21頁SDS-凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。 加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使P二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到P分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負電荷，形狀為長橢圓形，短軸一定，長軸長度正比于P分子量。 分離測定： 測分子量（與標準蛋白比較） 鑒定樣品純度（條帶數(shù)

7、目） 測定樣品P含量：掃描定量（比色）第13頁/共21頁凝膠電泳的操作要點 1 凝膠制備 2 電極緩沖液 3 樣品處理及加樣 4 電泳 5 染色與固定 6 脫色 7 分析第14頁/共21頁第15頁/共21頁第16頁/共21頁煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化第17頁/共21頁六 等電點聚焦電泳 電泳系統(tǒng)中加進兩性電解質(zhì)載體，當通已直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。P進入時，不同的P移動到與其等電點相當?shù)膒H位置上，從而使不同等電點的P得以分離。 優(yōu)點：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定P或多肽的等電點。 缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的P。第18頁/共21頁 1 穩(wěn)定的pH梯度的形成 2 兩性電解質(zhì)載體 要求： 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備（有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體） 3 支持pH梯度的介質(zhì) 密度梯度溶液（用于自由電泳） 凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠） 4 操作要點 pH梯度支持介質(zhì)的制備 聚焦電泳 檢測 兩性電解質(zhì)載體的除去第19頁/共21頁電泳技術(shù)思考題 1名詞解釋 電泳、電泳分離技術(shù)、泳動度、電滲、區(qū)帶電泳、相對遷移率、不連續(xù)凝膠電泳 2 影響泳動度的主要因素有哪些？ 3