實驗四定磷法測定核酸含量(精)

1、實驗四定磷法測定核酸含量一、目的掌握定磷法測定核酸含量的原理與方法。二、原理核酸分子中含有一定比例的磷，RNA 中含磷量為 9.0%, DNA 中含磷量為9.2%，因此通過測得核酸中磷的量即可求得核酸的量。用強酸使核酸分子中的有機磷消化成為無機磷，使之與鉬酸銨結合成磷鉬酸銨(黃色沉淀)。PO42-+3NH4+12MoO42-+24H+=(NH4)3PO412 MoO3 6H2O；+6H2O當有還原劑存在時，Mo6+被還原成 Mo4+，此 4 價鉬再與試劑中的其他 MoO42-結合成 Mo(MoO4)2 或 Mo3O8，呈藍色，稱為鉬藍。在一定濃度范圍內(nèi)，藍色的深淺和磷含量成正比，可用比色法測定

2、。樣品中如有 無機磷，應將無機磷扣除，否則結果偏高。三、實驗器材1、粗核酸(RNA)2、克氏燒瓶 50ml (X2 )。3、小漏斗 4cm(X1 )。4、容量瓶 100ml (X2 )、50ml (X1 )。5、吸管 0.10ml (X1 )、0.20ml (X2 )、0.50ml (X1 )、1.0ml (X2)、5.0ml(X4)。6、試管 1.5cm X 18cm (X11)。7、722 型或 2000 型分光光度計。&電爐。9、水浴鍋。四、實驗試劑1 標準磷溶液：將磷酸二氫鉀(A.R.)于 100C烘至恒重，準確稱取 0.8775 溶于 少量蒸餾水中，轉移至 500ml 容量瓶

3、中，加入 5ml5mol/L 硫酸溶液及氯仿數(shù)滴， 用蒸餾水稀釋至刻度，此溶液每毫升含磷 400g臨用時準確稀釋 20 倍(20 卩 g/m)。2.定磷試劑(1) 17%硫酸：17ml 濃硫酸(比重 1.84)緩緩加入 83ml 水中。(2) 2.5%鉬酸 銨溶液：2.5g 鉬酸銨溶于 100ml 水。(3) 10%抗壞血酸溶液：10g 抗壞血酸溶于 100ml 水，存于棕色瓶中放于冰箱。 溶液呈淡黃色尚可用，呈深黃甚至棕色即失效。臨用時將上述三種溶液與水按如下比例混合，V（17 %硫酸）:V（2.5 %鉬酸銨溶液）:V（10 %抗壞血酸溶液）:V（水戸 1: 1: 1: 2。3. 5%氨水。

4、4. 30%過氧化氫5. 27%硫酸：27ml 硫酸（比重 1.84, A.R.）緩緩倒入 73ml 水中。五、操作1.磷標準曲線的繪制取干試管 9 支，按表編號及加入試劑。 核酸含量的測定一一標準曲線的繪制試利012345b7杯準絢熔幽 nl00.05OJ0.20.J0.40,50.60.72.952.*i2.82.72 血1.52.4233.03.0345.03.03.0J.0加畢搖勻，45C水浴中保溫 10min,冷卻，測定吸光度（660nm）。以磷含量為 橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。2.總磷的測定稱取樣品（粗核酸）0.1g，用少量蒸餾水溶解（如不溶，可滴加 5%氨水至 pH7.0）,轉

5、移至 50ml 容量瓶中，加水至刻度（此溶液含樣品 2mg/ml）。吸取上述樣液 1.0ml，置于 50ml 克氏燒瓶中，加入少量催化劑，再加 4.0ml 濃硫 酸及 3 粒玻璃珠，克氏燒瓶中內(nèi)插一小漏斗，放在通風廚內(nèi)加熱，消化至透明， 表示消化完成。冷卻，將消化液移入 100ml 容量瓶中，用少量水洗滌克氏燒瓶兩 次，洗滌液一并倒入容量瓶，再加水至刻度，混勻后吸取3.0ml 置于試管中，加定磷試劑 3.0ml，45E水浴中保溫 10min，測 A660nm。3. 無機磷的測定吸取樣液（2mg/ml） 1.0ml，置于 100ml 容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取3.0ml 置試管中，加定磷試劑 3.0ml，45C水浴中保溫 10min，測 A660nm。4. 計算：總磷 A660nm-無機磷 A660nm =有機磷 A660nm由標準曲線查得有機磷的質量（yg,再根據(jù)測定時的取樣毫升數(shù)，求得有機磷 的質量濃度（卩 g/m。按下式計算樣品中核酸的質量分數(shù)：CVX11X100%m式中 W:核酸的質量分數(shù)（%）；C:有機磷的質量濃度（卩 g/m）;V :樣品總體積（ml）；11:因核酸