生物工程下游技術(shù)第三章 微生物細(xì)胞破碎

1、酶來源應(yīng)用實(shí)例L-天冬酰氨酶Erwinia Carotovora治療急性淋巴癌過氧化氫酶Aspergillus niger牛奶滅菌后H2O2的清除膽固醇氧化酶Nocardia rhodochrous膽固醇漿液分析半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖異構(gòu)酶Bacillus Cogulans高果葡萄糖漿的生產(chǎn)葡萄糖氧化酶Aspergillus niger葡萄糖漿液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Yeast臨床分析蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜餞青霉素?；窫scherichia Coli芐青霉素的脫酰作用藥

2、物名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒癥干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤 脂蛋白脂多糖脂質(zhì)雙層細(xì)細(xì) 胞胞 壁壁特殊組分：特殊組分：外外膜膜h肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺h氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸h磷壁質(zhì)h糖h脂質(zhì)G+ 菌肽聚糖結(jié)構(gòu)菌肽聚糖結(jié)構(gòu):五肽交聯(lián)橋五肽交聯(lián)橋 五個(gè)甘氨酸五個(gè)甘氨酸四肽側(cè)鏈四肽側(cè)鏈 L-丙、丙、D-谷、谷、L-賴、賴、D-丙丙聚糖骨架聚糖骨架 G：N-乙酰葡萄胺乙酰葡萄胺 M：N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸聚糖骨架聚糖骨架： 同G+ 菌四肽側(cè)鏈四肽側(cè)鏈： L-丙、D-谷 DAP、D-丙G- 菌

3、肽聚糖結(jié)構(gòu)菌肽聚糖結(jié)構(gòu):細(xì)胞壁細(xì)胞壁革蘭陽性菌革蘭陽性菌革蘭陽性菌革蘭陽性菌強(qiáng)度強(qiáng)度較堅(jiān)韌較堅(jiān)韌較疏松較疏松厚度厚度20-80nm10-15nm肽聚糖層數(shù)肽聚糖層數(shù)可多達(dá)可多達(dá)560層層1-2層層肽聚糖含量肽聚糖含量占細(xì)胞壁干重占細(xì)胞壁干重50%-80%占細(xì)胞壁干重占細(xì)胞壁干重5%-20%磷壁酸磷壁酸有有無無外膜外膜無無有有細(xì)細(xì) 胞胞 壁壁項(xiàng)目項(xiàng)目革蘭陽性菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌革蘭陰性菌細(xì)胞壁的關(guān)系細(xì)胞壁的關(guān)系染色性紫色紅色細(xì)胞壁對(duì)酒精的通透性抗原性主要為磷壁酸主要為外膜細(xì)胞壁的化學(xué)組成不同毒性無內(nèi)毒素有內(nèi)毒素內(nèi)毒素為陰性菌細(xì)胞壁成分 脂多糖對(duì)青霉素的作用有效無效青霉素作用部位為肽聚糖 五肽交

4、聯(lián)橋?qū)θ芫傅淖饔糜行o效溶菌酶作用部位為肽聚糖 聚糖骨架細(xì)細(xì) 胞胞 壁壁細(xì)胞膜細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)緊包細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞基本相同。位于細(xì)胞壁內(nèi)緊包細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞基本相同。功功能能細(xì)胞膜電鏡照片細(xì)胞膜電鏡照片分泌呼吸分泌呼吸載體蛋白載體蛋白脂質(zhì)雙層脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜模式結(jié)構(gòu)圖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)生物合成生物合成特殊結(jié)構(gòu)莢莢 膜膜化學(xué)組成：化學(xué)組成：功能：功能：肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌Capsule多糖或多肽抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)損傷作用產(chǎn)汽莢膜桿菌糖及其氨基衍生物氨基酸脂質(zhì) 細(xì)胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777G-芽孢桿菌和球菌6566G+芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5G+球

5、菌3.5(2)325孢子2(1)21菌絲16(1)5一、破碎率的評(píng)價(jià) 破碎率：被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：%100/ )(%)00NNNY1、直接計(jì)數(shù)法 平板計(jì)數(shù)法血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器2、間接計(jì)數(shù)法產(chǎn)物測(cè)定法電導(dǎo)法 細(xì)胞破碎 機(jī)械非機(jī)械液體剪切固體剪切超聲波：超聲波機(jī)械攪拌：振動(dòng)器壓力：Chaikoff 擠壓機(jī)研磨：研棒、研缽、珠磨壓力：X-壓濾機(jī)干燥溶胞物理：滲透沖擊化學(xué)：陰、陽離子洗滌劑酶：溶菌酶、酶噬菌體溶胞真空干燥 空氣干燥 冷凍干燥 溶劑干燥 原理：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一齊攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的相互

6、剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律：)(RRkdtdRmRm能使放出的蛋白質(zhì)最大數(shù)量(mg/g)R為t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量(mg/g)k破碎的比速度 ktxRRRmm11ln)/(lnmRRx/KR)1/(1lnqvV /轉(zhuǎn)盤外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小溫度流量I延長研磨時(shí)間I增加珠體裝量I提高攪拌速度I提高操作溫度2、液體剪切法（高壓勻漿法）、液體剪切法（高壓勻漿法） 原理：利用高壓使細(xì)胞破碎。不宜采用高壓勻漿的破碎的微生物細(xì)胞：v已造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌；v較小的革蘭氏陽性菌；v含有包含體的基

7、因工程菌 高達(dá)20,000PSI(約138MPA)以上的壓縮氣體，可以有效的將細(xì)胞膜打破。 可溶蛋白的集聚超過溶解度；可溶蛋白的集聚超過溶解度； 蛋白合成太快，導(dǎo)致分子間疏水相互作用聚合而不溶；蛋白合成太快，導(dǎo)致分子間疏水相互作用聚合而不溶； 高表達(dá)的蛋白沒有形成正常的二硫鍵連接；高表達(dá)的蛋白沒有形成正常的二硫鍵連接； 蛋白的助溶物缺乏；蛋白的助溶物缺乏； 包含體的形成與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。包含體的形成與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。包含體:蛋白相互交聯(lián) 在一起形成不溶性的聚集物 蛋 白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體-丙酰胺酶20%在細(xì)胞區(qū)間-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形

8、成包含體牛生長激素30%形成包含體-內(nèi)酰胺酶形成區(qū)間包含體人胰島素原6%26%形成包含體R：蛋白質(zhì)釋放量；Rm：蛋白質(zhì)最大的釋放量；p：操作壓力；k：速率常數(shù)；：與微生物種類有關(guān)的常數(shù)kNpRRRmmlnZ：常數(shù)P：破碎壓力P0：臨界壓力：細(xì)胞濃度參數(shù)/ )(exp10ZppR超聲波引起空穴，在相當(dāng)高的輸入聲能超聲波引起空穴，在相當(dāng)高的輸入聲能下，液體各部分會(huì)形成許多小氣泡，在聲波膨下，液體各部分會(huì)形成許多小氣泡，在聲波膨脹相中，這些氣泡會(huì)增大，而在壓縮相中氣泡脹相中，這些氣泡會(huì)增大，而在壓縮相中氣泡會(huì)被壓縮，直到不能在壓縮時(shí)，氣泡破破裂，會(huì)被壓縮，直到不能在壓縮時(shí)，氣泡破破裂，釋放出猛烈的陣

9、。這種震波通過介質(zhì)傳播。在釋放出猛烈的陣。這種震波通過介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量身能轉(zhuǎn)化氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量身能轉(zhuǎn)化成彈性形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使成彈性形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎。I 蛋白釋放常數(shù)k取決于輸入的聲能。) tKexp(R1pP/ )WW(K0p桿菌球菌;革蘭氏陰性革蘭氏陽性;細(xì)菌酵母.振幅；細(xì)胞懸浮液的粘度；表面張力；被處理懸浮液的體積；探頭的形狀和材料；細(xì)胞懸浮液的流速；E 需要高的能量并且生產(chǎn)高溫和高的剪切力，易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；E 破碎非專一性；E 碎片尺寸分布廣泛。 原理：利用酶分解細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵

10、使之破壁的一種方法。 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品的選擇性高； 抽提的速率和收率高； 產(chǎn)品破壞最少； 對(duì)pH和溫度等外界條件要求底； 不留細(xì)胞殘片。 缺點(diǎn)：酶的費(fèi)用高；通用性差；產(chǎn)物抑制 分類：外加酶法；自溶法生物體酶水解鍵的類型細(xì)菌糖苷酶N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酸酰胺酶多肽酶肽聚糖中AGA和AAM之間的（1、4）-鍵殘基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁?；鶜埢蚅-氨基酸殘基之間的鍵；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽鍵。真菌、酵母-（1，3）-葡聚糖酶-（1，6）-浦聚糖酶甘露聚糖酶甲殼素酶蛋白酶聚糖中隨機(jī)（1，3）-鍵聚糖中隨機(jī)（1，6）-鍵（1，2）-或（1，3）-或（1，6）-D甘露糖苷鍵甲殼糖和殼糊精

11、中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基（1，4）-B-鍵藻類纖維素酶纖維素中的（1，4）-鍵5、化學(xué)法、化學(xué)法原理：用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些 組分的方法。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物有選擇性 細(xì)胞外形保持完整，碎片少。缺點(diǎn)：通用性差 時(shí)間長 有些化學(xué)試劑有毒性用于化學(xué)法的試劑種類： 酸堿調(diào)節(jié) 有機(jī)溶劑 表面活性劑 EDTA鰲合劑 變性劑細(xì)胞類別變性劑清潔劑有機(jī)溶劑 酶抗生素生物試劑鰲合物G-菌*G+菌*酵母菌*植物細(xì)胞*巨噬細(xì)胞*滲透壓法反復(fù)凍結(jié)融化法干燥法X-press法多種破碎方法相結(jié)合與上游過程相結(jié)合培養(yǎng)過程控制寄主細(xì)胞的選擇克隆噬菌體溶解基因耐高溫產(chǎn)品基因表達(dá)與下游過程結(jié)合細(xì)胞壁：* 提供機(jī)械強(qiáng)度給細(xì)胞，使其成為一個(gè)整體* 由于其伸縮特性，使細(xì)胞承受外部環(huán)境滲透壓的快速變換