DBI講座--qPCR技術(shù)--細(xì)節(jié)決定成敗

1、中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所博士博士 DBI Bioscience 5DBI Bioscience 5年年 資深專家資深專家 黨希龍黨希龍 程濤程濤細(xì)節(jié)決定成敗QPCRQPCR的技術(shù)細(xì)節(jié)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響的技術(shù)細(xì)節(jié)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響DBI Bioscience主要做什么？我們有哪些優(yōu)勢產(chǎn)品？我們?yōu)橹袊目蛻魩砀玫?FREE!FREE!DBI Bioscience實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)試劑使用儀器使用技術(shù)細(xì)節(jié)結(jié)果分析新的選擇我們的生產(chǎn)地路德維希港（德國）我們?yōu)槟峁W洲領(lǐng)先的QPCR試劑我們在網(wǎng)絡(luò)存在：嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)、質(zhì)量可靠，技術(shù)先進(jìn)、選材嚴(yán)格，良好的技術(shù)性和耐久性、

2、不計(jì)成本節(jié)能、成本控制好，舒適性和使用便利性最大一些不容易被發(fā)現(xiàn)的零部件質(zhì)量低，qPCR Mix 對比實(shí)驗(yàn)3種qPCR Mix包括：SYBR Green法：法：SYBR Premix Ex Taq (Tak公司 )StormStar SybrGreen PCR Master Mix（DBI-2143）BeStar SybrGreen qPCR Master Mix（DBI-2043）第1部分模板：模板：人源 cDNA引物：引物：IC 1 (for SYBR Green)SYBR Green:Mix 10 uLRox 0.4 uLTemplate 4 uLPrimer F(10uM) 2 uLP

3、rimer R (10uM) 2uLH2O 1.6 uL95 5 min95 15 s50 45 s40 cycles10 ng/well1 ng/well0.1 ng/well0.01ng/well1 pg/well0.1 pg/well0.01 pg/well1 fg/well使用7300熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測Tak公司 SYBR Premix Ex TaqStromStar Realtime PCR Master Mix（DBI-2143）BeStar SybrGreen qPCR Master Mix（DBI-2043）擴(kuò)增曲線Tak公司 SYBR Premix Ex TaqStro

4、mStar Realtime PCR Master Mix（DBI-2143）BesStar SybrGreen qPCR Master Mix（DBI-2043）模板濃度(/well)Ct 值1fg35.19 34.92 0.01pg31.55 31.15 0.1pg27.68 27.76 1pg23.77 24.05 0.01ng20.72 20.59 0.1ng17.11 17.05 1ng13.44 13.21 10ng9.03 9.23 模板濃度(/well)Ct 值1fg/well34.09 34.40 0.01pg/well31.00 31.23 0.1pg/well27.58

5、27.44 1pg/well23.78 23.86 0.01ng/well20.39 20.34 0.1ng/well16.83 17.15 1ng/well13.49 13.46 10ng/well9.95 9.93 模板濃度(/well)Ct 值1fg/well33.28 33.95 0.01pg/well29.19 30.17 0.1pg/well26.55 27.23 1pg/well23.27 23.17 0.01ng/well19.69 19.74 0.1ng/well16.40 16.34 1ng/well12.65 12.55 10ng/well7.97 8.57 總結(jié) 11.

6、 將cDNA模板進(jìn)行濃度梯度稀釋(10ng/well-1fg/well)，分別加入3種SYBR Green Mix，使用IC1引物進(jìn)行擴(kuò)增，Ct值與模板濃度有較好的線性關(guān)系，其中: Tak公司 SYBR Premix Ex Taq：R = 0.999 StromStar Realtime PCR Master Mix：R = 0.999 BeStar SybrGreen qPCR Master Mix：R = 0.998 說明在模板濃度較低的情況下模板濃度較低的情況下(1fg/well)，各，各Mix仍能使擴(kuò)增反應(yīng)保仍能使擴(kuò)增反應(yīng)保持特異性；持特異性；2. 3種SYBR GreenMix之間擴(kuò)

7、增效率沒有明顯區(qū)別；第2部分 qPCR mix擴(kuò)增miRNA的效果比較qPCR mix SYBR Green法：法：SYBR Premix Ex Taq (Tak公司，批號A3701 )SYBR Premix Ex Taq (Tak公司，批號A4504 )StormStar Realtime PCR Master Mix（DBI-2143）BeStar SybrGreen qPCR Master Mix（DBI-2043）Mix 10 uLRox 0.4 uLTemplate( hsa cDNA) 5 uL (1ng)Primer F (10uM) 2 uLUPM(10uM) 2 uLH2O

8、0.6 uL95 5 min95 15 s50 45 sDissociation Curve40 cyclesprimerTakara(A3701)Takara(A4504)DBI StormStarDBI BeStarmiR-18a-5p 25.06 24.95 25.56 24.98 miR-18a-3p 26.55 26.61 27.51 25.88 miR-139-5p 22.94 22.92 23.41 22.51 miR-140-5p 22.80 22.91 24.22 22.97 miR-142-5p 22.11 22.20 23.36 23.45 miR-143-3P 16.5

9、9 16.67 17.88 17.12 miR-144-3p 23.75 23.46 23.31 22.45 miR-145-5p 16.78 16.93 17.86 16.95 miR-146a-5p 23.09 23.11 24.41 22.98 miR-142-3p 20.76 20.78 20.49 20.62 miR-141-3p 27.77 30.98 24.77 22.26 miR-141-5p 30.33 30.48 29.35 26.76 miR-10a-3p 27.90 27.53 25.67 26.52 miR-145-3p33.77 32.91 25.94 24.66

10、2.1. Ct值比較綠色標(biāo)記：引物特異性較好(溶解曲線為單峰)橙色標(biāo)記：引物特異性較差(溶解曲線出現(xiàn)雙峰等)miR-18a-5p2.2. 擴(kuò)增曲線及溶解曲線舉例T-A3701T-A4504StormStarBesStar當(dāng)引物特異性較好(溶解曲線為單峰)時(shí)，4種mix之間擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)別，Ct值也較為接近；miR-141-5p 2.3 擴(kuò)增曲線及溶解曲線舉例T-A3701T-A4504StormStarBesStar當(dāng)引物特異性不夠時(shí)(溶解曲線出現(xiàn)雙峰等)， 4種mix擴(kuò)增效果差異較大。miR-139-3p 2.4 擴(kuò)增曲線及溶解曲線舉例T-A3701T-A4504StormStarBes

11、StarStormStarT-A3701T-A4504BesStar擴(kuò)增miR-139-3p時(shí)， Tak公司(A3701)，Tak公司(A4504)及DBI BeStar擴(kuò)增曲線也不正常，溶解曲線也均出現(xiàn)亂峰，僅僅DBI StormStar（DBI-2143）擴(kuò)增曲線正常，擴(kuò)增曲線正常，溶解曲線為單峰溶解曲線為單峰。 當(dāng)引物特異性較好(溶解曲線為單峰)時(shí)，4種mix之間擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)別，Ct值也較為接近； 當(dāng)引物特異性不夠時(shí)當(dāng)引物特異性不夠時(shí)(溶解曲線出現(xiàn)雙峰等溶解曲線出現(xiàn)雙峰等)， 4種種mix擴(kuò)增效果差異較大，擴(kuò)增效果差異較大，整體說來整體說來DBI StormStar和和DBI Be

12、Star比比Tak公司公司(A3701)Tak公司公司(A4504)的的Ct值更小值更小 ；Tak公司 mix兩個(gè)批次之間(A3701和A4504)沒有明顯差異；DBI BeStar與兩種與兩種Tak公司公司 mix沒有明顯差異；沒有明顯差異；使用質(zhì)量較差的引物時(shí)，使用質(zhì)量較差的引物時(shí)， DBI StormStar具有更高的特異性具有更高的特異性(相比相比另外另外3種種mix)；小結(jié)2SYBR Green mix 檢測批次：檢測批次：BesStar SybrGreen qPCR Master Mix -619（DBI-2043）BesStar SybrGreen qPCR Master Mix

13、 -621（DBI-2043）BesStar SybrGreen qPCR Master Mix-623（DBI-2043）SYBR Green qPCR Master Mix（Tak公司，A4504）第3部分 三批次DBI SYBR mix與Takara的對比實(shí)驗(yàn)Mix 10 uLRox 0.4 uLTemplate( 血漿 cDNA) 0.1 uL Primer F (10uM) 2 uLUPM(10uM) 2 uLH2O 5.5 uL95 5 min95 15 s60 45 sDissociation Curve40 cycles3.1. Ct值比較橙色標(biāo)記：DBI三個(gè)批次的三個(gè)批次的m

14、ix擴(kuò)增擴(kuò)增Ct值明顯小于值明顯小于Tak公司公司其他無標(biāo)記：DBI三個(gè)批次的mix之間與Takara之間均無明顯差異primer/mixDBI-619DBI-621DBI-623TAKARAmiR-1新28.93 28.48 28.86 26.57 28.43 28.45 28.61 28.76 29.26 33.76 34.52 miR-122-5p新22.95 22.04 22.82 22.38 22.88 23.09 23.03 23.32 24.09 26.20 25.39 miR-146a-5p25.14 24.91 24.89 22.48 24.84 25.00 24.93 25

15、.18 25.18 25.49 25.21 miR-22-3p20.55 20.62 20.82 20.66 20.74 20.79 20.76 20.76 20.82 21.17 20.65 miR-25-3p20.25 20.27 20.28 20.20 20.03 20.19 20.31 20.27 20.61 20.56 20.19 miR-451a13.72 13.99 13.63 13.45 13.51 13.54 13.88 13.73 13.87 14.22 13.89 miR-92a-3p18.75 18.88 18.89 18.77 19.18 18.74 18.94 19

16、.11 19.29 19.37 18.93 EC1新17.72 17.62 17.48 17.44 17.66 17.83 17.92 18.20 18.48 17.77 17.72 miR-13.2. 擴(kuò)增曲線及溶解曲線舉例當(dāng)引物擴(kuò)增Ct值較大（30左右，且引物特異性較差）時(shí)，DBI三三個(gè)批次的擴(kuò)增性能優(yōu)于個(gè)批次的擴(kuò)增性能優(yōu)于Tak公司公司 mix。BesStarT-A4504BesStarT-A4504miR-22-3p3.3. 擴(kuò)增曲線及溶解曲線舉例當(dāng)引物擴(kuò)增Ct值較?。ㄕU(kuò)增）時(shí)，DBI三批次的擴(kuò)增性能三批次的擴(kuò)增性能等于等于Tak公司公司 mix。但融解曲線相對更好。但融解曲線相對

17、更好。BesStarT-A4504BesStarT-A4504 當(dāng)引物特異性較好當(dāng)引物特異性較好(溶解曲線為單峰溶解曲線為單峰)時(shí)，時(shí)，4種種mix之間擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)別，之間擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)別，Ct值也較為接近；值也較為接近； 當(dāng)引物特異性不夠時(shí)當(dāng)引物特異性不夠時(shí)(溶解曲線出現(xiàn)雙峰等溶解曲線出現(xiàn)雙峰等)， DBI三種三種mix擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)擴(kuò)增效果沒有明顯區(qū)別，但別，但Ct值數(shù)據(jù)都小于值數(shù)據(jù)都小于Tak公司公司 mix；使用質(zhì)量較差的引物時(shí)，使用質(zhì)量較差的引物時(shí)， 選用選用DBI mix可以得到更優(yōu)的數(shù)據(jù)可以得到更優(yōu)的數(shù)據(jù)，但需補(bǔ)充陰，但需補(bǔ)充陰性對照數(shù)據(jù)來進(jìn)行判定；性對照數(shù)據(jù)來進(jìn)行

18、判定；小結(jié)3使用DBI Bioscience的qPCR(SYBR GREEN)最近發(fā)表的文章（影響因子20.22分）張彥波張彥波 May 13, 2014內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)與常規(guī) PCR技術(shù)比較：技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)

19、確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測熒光定量熒光定量PCR原理原理 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線 熒光閾值熒光閾值 Ct值值熒光定量熒光定量PCR原理原理 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。擴(kuò)增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。 反應(yīng)初期反應(yīng)初期，目的，目的DNA片段呈片段呈指數(shù)擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的。隨著目的DNA產(chǎn)產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”，又稱，

20、又稱“平臺期平臺期”。到。到達(dá)平臺期所需達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達(dá)平臺期前，競爭等因素。到達(dá)平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行聚合酶一般要進(jìn)行25次次以上以上PCR循環(huán)。循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺期在多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應(yīng)中不可避免。反應(yīng)中不可避免。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律產(chǎn)物的積累規(guī)律 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理擴(kuò)增曲線熒光定量熒光定量PCR定量原理定量

21、原理為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確呢？為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確呢？熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理 盡管終點(diǎn)產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)盡管終點(diǎn)產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)CtCt（cycle thresholdcycle threshold）與模板起始濃度有密切聯(lián)系。與模板起始濃度有密切聯(lián)系。Ct值的定義：值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)CycleCycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）RnRn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）Ct value 熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值值1 前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）1 熒光閾值的缺省設(shè)置是315

22、個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍1 手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段1 真正的信號:熒光信號超過閾值熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光閾值熒光閾值定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)No Template Control(NTC)No Template Control(NTC)確認(rèn)確認(rèn)PCRPCR擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E E）:0.9-1.1:0.9-1.135Cycles35Cycles

23、內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用如果采用SYBRSYBR檢測方法，檢測方法，30Cycles30Cycles內(nèi)無非特內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增異性產(chǎn)物擴(kuò)增35 Cycles35 Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.98熒光定量熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)反應(yīng)性的確認(rèn)內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法非特異性熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I特異

24、性熒光標(biāo)記特異性熒光標(biāo)記 TaqMan Probe常用熒光標(biāo)記方法常用熒光標(biāo)記方法SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法作用機(jī)理作用機(jī)理問題點(diǎn)：問題點(diǎn)： SYBR Green ISYBR Green I與雙鏈與雙鏈DNADNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增非特異性擴(kuò)增或或引物二聚體引物二聚體的產(chǎn)生，的產(chǎn)生，也將也將 同時(shí)被檢測到，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)

25、確。同時(shí)被檢測到，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)： 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！原始圖譜原始圖譜對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線融解曲線分析，單一融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)性熒光，因此定量不準(zhǔn)確確SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線

26、融解曲線% 對對DNA模板沒有選擇性模板沒有選擇性% 使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針% 具有價(jià)格優(yōu)勢具有價(jià)格優(yōu)勢優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)% 容易產(chǎn)生假陽性容易產(chǎn)生假陽性 % 對引物特異性要求較高對引物特異性要求較高% 不能進(jìn)行多重定量不能進(jìn)行多重定量缺缺 點(diǎn)點(diǎn)SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)TaqmanTaqman探針法探針法原理原理 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核

27、酸酶活性，可水解探針TaqmanTaqman探針法探針法工作機(jī)理工作機(jī)理1 1、引物、探針的設(shè)計(jì)：、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 3 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小CtCt值，最大信號值，最大信號/ /背景比值背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4

28、4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCRPCR相同相同TaqmanTaqman探針法探針法PCRPCR體系的建立體系的建立TaqmanTaqman探針法探針法熒光標(biāo)記物的選擇熒光標(biāo)記物的選擇% 高度特異性高度特異性% 重復(fù)性好重復(fù)性好% 可進(jìn)行多重定量可進(jìn)行多重定量優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)% 只適合一個(gè)特定的目標(biāo)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)% 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高% 不易找到本底低的探針不易找到本底低的探針缺缺 點(diǎn)點(diǎn)TaqmanTaqman探針法探針法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)不同定量方法的比較不同定量方法的比較方法方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍適用范圍SYBR Green I SYBR Green I 方法方法適

29、用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性易出現(xiàn)非特異性帶帶不能進(jìn)行多重定不能進(jìn)行多重定量量適合科研中對各種目的適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究組動植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定量價(jià)格高價(jià)格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥病原體檢測，疾病耐藥基因研究基因研究, ,藥物療效考藥物療效考核核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法

30、 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析儀器軟件儀器軟件RTRT上機(jī)上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇分析方法分析方法樣品制備樣品制備環(huán)境要求環(huán)境要求模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RTRT上機(jī)上機(jī)濃度確定濃度確定 無無RNaseRNase環(huán)境環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具分光光度計(jì)檢測電泳檢測（28s,18s,5s）保存，分裝RTRT反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試

31、劑選擇樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)AMVM-MLV DBI BioscienceQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物，反應(yīng)效率選擇應(yīng)用引物，反應(yīng)效率模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)濃度確定濃度確定環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制RTRT樣品制備樣品制備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)冰上操作制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價(jià)引物使用使用mixmix降低系統(tǒng)誤差降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（3次）設(shè)置空白和陰性對照試用于機(jī)器要求濃度的ROX校正染料GC：5060Tm：556060單個(gè)堿基重復(fù)4個(gè)無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：擴(kuò)增長度：5050150bp150

32、bp引物位置（逆轉(zhuǎn)錄的效率 跨內(nèi)含子）反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積反應(yīng)體積5ul5ul，推薦，推薦202050ul50ulMg2調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90110重復(fù)性：std0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R0.99或R2 0.98標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照45oC55oC65oC溶解曲線溶解曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC f

33、or 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.技能要求技能要求誤差控制誤差控制上機(jī)上機(jī)試劑選擇試劑選擇RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析自配DBI qPCR mastermixRoche-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7series

34、BioerLinegene series分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制同一cDNA樣品的三個(gè)重復(fù)如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴(kuò)增曲線上的如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴(kuò)增曲線上的CTCT值之差，應(yīng)該相等，但值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品是后邊幾個(gè)濃度低的樣品CTCT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。1. 1. 模板濃度越低，染料法的誤差越大模板濃度越低，染料法的誤差越大2. 2. 某一孔熒光信號特別強(qiáng)某一孔熒光信號特別強(qiáng)原因：原因： 試劑配制時(shí)反應(yīng)液

35、沒完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管中增多；試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管中增多； 試劑配制時(shí)沒有充分混勻致各管中各成分的量不同；試劑配制時(shí)沒有充分混勻致各管中各成分的量不同； 也可能是也可能是PCRPCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時(shí)就要清除熱槽中的污染；儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時(shí)就要清除熱槽中的污染；3.3.樣品濃度跨度過大樣品濃度跨度過大樣品濃度過高，至陽性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，樣品濃度過高，至陽性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，4. 部分樣本擴(kuò)增效率過低部分樣本擴(kuò)增效率過低原因：原因： 提取液殘留，一定程度抑制了提取液殘留，一定程度抑制了PCRPCR反應(yīng)；反

36、應(yīng)； 反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻；試劑失效；均勻；試劑失效；5.5. 陰性對照或空白對照翹尾陰性對照或空白對照翹尾原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過程存在污染；原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過程存在污染；6. 6. 直線型擴(kuò)增曲線直線型擴(kuò)增曲線原因：探針部分降解（探針降解原因：原因：探針部分降解（探針降解原因：a.a.探針反復(fù)凍融探針反復(fù)凍融稀釋的探針可在稀釋的探針可在44保存保存至少至少3 3個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；b.b.探針在光線下暴露時(shí)間太長）；反應(yīng)液中有探針在光線下暴露時(shí)間太長）；反應(yīng)

37、液中有PCRPCR抑制抑制物；物；7. 7.山坡形曲線山坡形曲線原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。舉例說明：8.8.擴(kuò)增曲線斷裂擴(kuò)增曲線斷裂原因：基線選取范圍不對，基線終點(diǎn)大于原因：基線選取范圍不對，基線終點(diǎn)大于CtCt值，這通常是由于模板值，這通常是由于模板DNADNA濃度過高所致，濃度過高所致，因因CtCt值值1515，而基線范圍仍取，而基線范圍仍取3 31515，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至CtCt值前值前4 4個(gè)循環(huán)

38、，重新分析數(shù)據(jù)個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)9.9.基線下滑基線下滑原因：基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致；原因：基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致；10.10.沒有擴(kuò)增曲線沒有擴(kuò)增曲線原因：原因：PCRPCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，即即stage 1stage 1階段；電腦設(shè)定了自動休眠；階段；電腦設(shè)定了自動休眠；11. 擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰原因原因： 反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定；可能在反應(yīng)過程中

39、電壓不穩(wěn)定；可能在2020循環(huán)左右儀器有停下或者儀器有開蓋，循環(huán)左右儀器有停下或者儀器有開蓋，使得光線突然增強(qiáng)；使得光線突然增強(qiáng)； 如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣拢@時(shí)應(yīng)更換；如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣?，這時(shí)應(yīng)更換；數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)分析方法分析方法上機(jī)上機(jī)RT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備相對定量：2Ct法絕對定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法絕對定量解析方法絕對定量解析方法Sample2

40、5絕對定量的定義絕對定量的定義0 Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系0 根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆質(zhì)粒質(zhì)?；蚪M基因組DNADNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備拷貝數(shù)的計(jì)算：拷貝數(shù)的計(jì)算：待測樣本濃度（ng/ul）OD26040稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量61014倍比梯度稀釋方法倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii

41、1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算q 方方 法：法：從組織中提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以SYBR法進(jìn)行熒光定量檢測q 試試 劑：劑：DBIDBI公司SYBR realtime PCR試劑q 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105 、104 、 103 ；2個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對照q 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：提取RNA并反轉(zhuǎn)錄； 設(shè)計(jì)特異引物； 熒光定量擴(kuò)增； 結(jié)果分析：獲取樣品中目的基因的精確copy數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)例絕對定量實(shí)驗(yàn)例SampleSamplecopies/mlco

42、pies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD標(biāo)準(zhǔn)品510328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品510425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品510522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品510618.6318.9218.770.10未知樣品? ?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)絕對定量實(shí)驗(yàn)例絕對定量實(shí)驗(yàn)例擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E E）計(jì)算）計(jì)算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用利用Mean Ct Mean Ct 作圖可得到標(biāo)

43、準(zhǔn)曲線作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988絕對定量實(shí)驗(yàn)例絕對定量實(shí)驗(yàn)例未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：20.5= -3.1726 X + 37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 絕對定量實(shí)驗(yàn)例絕對定量實(shí)驗(yàn)例X=20.5-37.52-3.1726=5.36相對定量解析方法相對定量解析方法相對定量的必要性相對定量的必要性管家基因篩選管家基因篩選P P P P P P O O 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -Ct法法 兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測

44、樣品的目的基因及管通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對值即家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。為相對表達(dá)量。 相對值相對值= =校正值校正值= =目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值待測樣品的校正值對照樣品的校正值對照樣品的校正值雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：公式：優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對簡單優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對簡單缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品檢測樣品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量結(jié)果定