第五章 親和層析-2012

1、第五章第五章 親和層析分離技術(shù)親和層析分離技術(shù)第一節(jié)親和層析概述第一節(jié)親和層析概述 利用生物分子間專一的利用生物分子間專一的親和力親和力而進(jìn)行分離而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)的一種層析技術(shù) 配體固定化的問題配體固定化的問題 在生物分離中有廣泛的應(yīng)用在生物分離中有廣泛的應(yīng)用 歷史 1910年就有人用不溶性淀粉選擇吸附、提純淀粉年就有人用不溶性淀粉選擇吸附、提純淀粉酶，這是最早的基于生物特異性進(jìn)行分離純化的酶，這是最早的基于生物特異性進(jìn)行分離純化的實(shí)例。實(shí)例。 但由于技術(shù)上的限制，主要是沒有合適的固定配但由于技術(shù)上的限制，主要是沒有合適的固定配體的方法，所以在實(shí)驗(yàn)中沒有廣泛的應(yīng)用。體的方法，所以在實(shí)驗(yàn)

2、中沒有廣泛的應(yīng)用。 1967年Axen等用溴化氰活化活化多糖凝膠偶聯(lián)偶聯(lián)肽和蛋白質(zhì)的方法，并成功地制備了固定化酶。此技術(shù)技術(shù)的出現(xiàn)，解決了配體固定化的問題，使得親和層的出現(xiàn)，解決了配體固定化的問題，使得親和層析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。 生物大分子的分離生物大分子的分離第二節(jié)親和層析基本原理及理論基礎(chǔ)第二節(jié)親和層析基本原理及理論基礎(chǔ) 親和力親和力 配體配體 固定相固定相 原理：原理：將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分

3、子進(jìn)行分離純化。純化。 親和力親和力 生物分子間存在很多特異性的相互作用，生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉的抗原抗體、酶底物或抑如我們熟悉的抗原抗體、酶底物或抑制劑、激素受體等等，它們之間都能夠制劑、激素受體等等，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親專一而可逆的結(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。和力。親和作用的本質(zhì)：親和作用的本質(zhì)：鑰匙和鎖孔的關(guān)系鑰匙和鎖孔的關(guān)系l靜電作用靜電作用l氫鍵氫鍵l疏水性相互作用疏水性相互作用l配位鍵配位鍵l弱共價(jià)鍵弱共價(jià)鍵 配體 與 固定相 親和層析的分離原理簡(jiǎn)單的說就是通過將親和層析的分離原理簡(jiǎn)單的說就是通過將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固

4、定在不溶具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化?？赡嫘裕瑢?duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。 被固定在基質(zhì)上的分子稱為被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體配體，eg:底物底物類似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑類似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,抗原抗原 配體和基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合的，構(gòu)成親和層析配體和基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的的固定相固定相，稱為親和吸附劑，稱為親和吸附劑. Eg:Sepharose ,一、親和層析基本原理一、親和層析基本原理分離原理分離原理 將制備的親和吸附劑將制備的親和吸附劑裝柱平衡裝柱平衡， 當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱

5、的時(shí)候，待分當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時(shí)候，待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合結(jié)合，從而留在固定相上；從而留在固定相上； 而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動(dòng)相而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動(dòng)相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。有待分離的生物分子。 通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫洗脫下來，下來，就得到了純化的待分離物質(zhì)就得到了純化的待分離物質(zhì) 二、親和層析的特點(diǎn)二、親和層析的特點(diǎn) 分辨率很高分辨率很高 分離速度快分離速度快 操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便 對(duì)設(shè)備要求不高對(duì)設(shè)備要求不高

6、 親和吸附劑通用性較差親和吸附劑通用性較差 洗脫條件較苛刻洗脫條件較苛刻 與其他層析技術(shù)比較與其他層析技術(shù)比較 吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等都是等都是利用各種分子間的利用各種分子間的理化特性理化特性的差異，如分子的吸的差異，如分子的吸附性質(zhì)、分子大小、分子的帶電性質(zhì)等等進(jìn)行分附性質(zhì)、分子大小、分子的帶電性質(zhì)等等進(jìn)行分離。離。 由于很多生物大分子之間的這種差異較小，所以由于很多生物大分子之間的這種差異較小，所以這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物質(zhì)通常需要多種方法結(jié)合使用，這不僅使分離需質(zhì)通常需要多種方

7、法結(jié)合使用，這不僅使分離需要較多的操作步驟、較長的時(shí)間，而且使待分離要較多的操作步驟、較長的時(shí)間，而且使待分離物的回收率降低，也會(huì)影響待分離物質(zhì)的活性。物的回收率降低，也會(huì)影響待分離物質(zhì)的活性。 親和層析親和層析是利用生物分子所具有的特異的是利用生物分子所具有的特異的生物學(xué)生物學(xué)性質(zhì)性質(zhì)親和力親和力來進(jìn)行分離純化的。由于親和力具來進(jìn)行分離純化的。由于親和力具有高度的專一性，使得親和層析的分辨率很高，有高度的專一性，使得親和層析的分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想的層析方法。是分離生物大分子的一種理想的層析方法。 三、親和層析的類型三、親和層析的類型 生物親和層析生物親和層析 免疫親和層析免

8、疫親和層析 固定化金屬離子親和層析固定化金屬離子親和層析 擬生物親和層析擬生物親和層析 生物親和層析生物親和層析 利用自然界中存在的生物特異性相互作用利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對(duì)的親和層析。物質(zhì)對(duì)的親和層析。 通常具有高的選擇性。通常具有高的選擇性。 典型的物質(zhì)對(duì)有酶典型的物質(zhì)對(duì)有酶-底物、酶底物、酶-抑制劑、激素抑制劑、激素-受體等。受體等。 免疫親和層析免疫親和層析 利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，稱的分離系統(tǒng)，稱免疫親和層析免疫親和層析。 免疫親和層析免疫親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛應(yīng)用相當(dāng)廣泛，許多典型的親和層，許多

9、典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為析純化蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體。目前，利用抗體抗原模式，有可能親和配體。目前，利用抗體抗原模式，有可能得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗，然后以單抗為配基，得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗，然后以單抗為配基，通過親和層析技術(shù)分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。此種方通過親和層析技術(shù)分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。此種方法的純化倍數(shù)活性回收率非常高。法的純化倍數(shù)活性回收率非常高。 用免疫層析柱進(jìn)行各種類型的免疫檢測(cè)被稱為用免疫層析柱進(jìn)行各種類型的免疫檢測(cè)被稱為免免疫檢測(cè)法疫檢測(cè)法，特別適用于檢測(cè)含量低微的樣品，特別適用于檢測(cè)含量低微的樣品4，免疫檢測(cè)法利用被標(biāo)記的抗體

10、或模擬分析物來進(jìn)免疫檢測(cè)法利用被標(biāo)記的抗體或模擬分析物來進(jìn)行間接的被分析物的分析。常用標(biāo)記如酶標(biāo)記、行間接的被分析物的分析。常用標(biāo)記如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)熒光等。熒光標(biāo)記、化學(xué)熒光等。固定化金屬離子親和層析固定化金屬離子親和層析 是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。 目的蛋白質(zhì)表面暴露的目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基供電子氨基酸殘基，如組，如組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬

11、離子結(jié)合，這是這是IMAC用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)5,6。 金屬離子如鋅和銅，已發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的金屬離子如鋅和銅，已發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合。含有不同數(shù)量的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合。含有不同數(shù)量的這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)可以通過金屬離子親和層析得這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)可以通過金屬離子親和層析得到分離。到分離。 擬生物親和層析擬生物親和層析 是利用部分分子相互作用，是利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位某特定部位。以人工合成的配基為固定相吸附目。以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質(zhì)的親和層析，的蛋白質(zhì)的親和層析， 如以染

12、料親和層析（如以染料親和層析（DAFC）和氨基酸）和氨基酸(包括多肽包括多肽)親和層析親和層析(AALA)7。染料配基，例如三嗪。染料配基，例如三嗪（triazine）或三苯甲烷化合物）或三苯甲烷化合物8，能通過共價(jià)，能通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合到親和載體上。鍵牢固地結(jié)合到親和載體上。 染料配體與很多蛋白以及酶的活性位點(diǎn)相互作用，染料配體與很多蛋白以及酶的活性位點(diǎn)相互作用，以模仿這些生物分子的底物、輔助因子或結(jié)合劑以模仿這些生物分子的底物、輔助因子或結(jié)合劑的形式進(jìn)行。的形式進(jìn)行。 四、親和層析載體四、親和層析載體 （一）親和層析對(duì)載體的要求（一）親和層析對(duì)載體的要求 載體要具有足夠數(shù)量的功能基團(tuán)載體

13、要具有足夠數(shù)量的功能基團(tuán) 有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性 有高度的水不溶性和親水性有高度的水不溶性和親水性 有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 載體在親和層析中的作用：載體在親和層析中的作用： 使配基固定化、空間環(huán)境使配基固定化、空間環(huán)境（二）常用載體（二）常用載體 纖維素 瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 葡聚糖凝膠 多孔玻璃珠 1. 纖維素纖維素 它是自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料，取材它是自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料，取材十分方便。十分方便。 但由于纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分但由于纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。活化后因帶有電荷，非

14、特異性吸附力子的滲入?；罨笠驇в须姾?，非特異性吸附力較強(qiáng)，加上空間位阻等原因，其應(yīng)用不如凝膠載較強(qiáng)，加上空間位阻等原因，其應(yīng)用不如凝膠載體廣泛。體廣泛。 目前主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)，如用寡聚目前主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)，如用寡聚脫氧胸腺核苷酸纖維素作固定相分離細(xì)胞提取液脫氧胸腺核苷酸纖維素作固定相分離細(xì)胞提取液中的中的mRNA。 市售纖維素商品為無定形微纖維、微晶纖維素以市售纖維素商品為無定形微纖維、微晶纖維素以及珠狀纖維素。及珠狀纖維素。 2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 是由是由D-半乳糖和半乳糖和3,6-脫水脫水-L-半乳糖相互結(jié)合的鏈半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖，用于親和層析的主要為

15、交聯(lián)珠狀凝膠。狀多糖，用于親和層析的主要為交聯(lián)珠狀凝膠。 瓊脂糖濃度有瓊脂糖濃度有2%、4%、6%幾種，相應(yīng)的商品稱幾種，相應(yīng)的商品稱為為Sepharose2B、4B和和6B(Pharmacia)和和Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。這類載體能使。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性，能迅速活化并接上各種功能吸附物質(zhì)保持活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快?；鶊F(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。 例如，例如，Sepharose 4B的分子量排阻極限達(dá)上百的分子量排阻極限達(dá)上百萬，便于大分子通過；載體幾乎沒有帶電基團(tuán)，萬，便于大分子通過；載體幾乎沒有帶電基團(tuán)，非專一性吸

16、附少。非專一性吸附少。 Sepharose CL是用是用1,3-二溴丙烷處理的交聯(lián)瓊脂二溴丙烷處理的交聯(lián)瓊脂糖，它的穩(wěn)定性明顯增加，能在糖，它的穩(wěn)定性明顯增加，能在pH 314中應(yīng)用，中應(yīng)用，Sepharose CL凝膠的這種穩(wěn)定性，擴(kuò)大了親和凝膠的這種穩(wěn)定性，擴(kuò)大了親和柱制備時(shí)化學(xué)反應(yīng)選用的范圍，并能經(jīng)受比較劇柱制備時(shí)化學(xué)反應(yīng)選用的范圍，并能經(jīng)受比較劇烈的洗脫條件。烈的洗脫條件。3. 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 是由丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)催化聚合形成是由丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)催化聚合形成的人工合成載體，是具有網(wǎng)狀三維空間結(jié)構(gòu)的凝的人工合成載體，是具有網(wǎng)狀三維空間結(jié)構(gòu)的凝膠型高聚物，

17、商品名為膠型高聚物，商品名為Biogel P。 與葡聚糖凝膠一樣，它也是一種干膠，遇水后溶與葡聚糖凝膠一樣，它也是一種干膠，遇水后溶脹成多孔凝膠。脹成多孔凝膠。 它具有穩(wěn)定的理化性能，適用于稀鹽溶液、洗滌它具有穩(wěn)定的理化性能，適用于稀鹽溶液、洗滌劑、鹽酸胍等溶液和許多有機(jī)溶劑，不受酶或微劑、鹽酸胍等溶液和許多有機(jī)溶劑，不受酶或微生物代謝產(chǎn)物的影響；生物代謝產(chǎn)物的影響； 有較多的可供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含有較多的可供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。量較高的親和柱，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。 但是但是pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解，還應(yīng)過高或過低

18、的溶液中酰胺基易水解，還應(yīng)避免接觸強(qiáng)氧化劑。此外，配基偶聯(lián)后會(huì)使它的避免接觸強(qiáng)氧化劑。此外，配基偶聯(lián)后會(huì)使它的網(wǎng)格縮小，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。網(wǎng)格縮小，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。 4. 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 是經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)，具有立體網(wǎng)格的多糖類物質(zhì)，其物理及化學(xué)性能比較穩(wěn)定。 與瓊脂糖凝膠相比較，葡聚糖凝膠孔徑太小，特別是經(jīng)配基偶聯(lián)后，凝膠膨脹度會(huì)進(jìn)一步變小，所以它的應(yīng)用也受到一定限制。 親和柱的不可逆吸附雜質(zhì)(如變性蛋白、脂類等)可用強(qiáng)堿處理除去。（產(chǎn)品說明）sephadex5. 多孔玻璃珠多孔玻璃珠(商品為商品為Bio-Glass) 它的化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高，不但它

19、的化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高，不但能抵御酶及微生物的作用，還能耐受高溫滅菌和能抵御酶及微生物的作用，還能耐受高溫滅菌和較劇烈的反應(yīng)條件。較劇烈的反應(yīng)條件。 缺點(diǎn)是親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)缺點(diǎn)是親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)有非特異性吸附，而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)也少。也少。 為了克服上述缺點(diǎn)，作載體用的市售為了克服上述缺點(diǎn)，作載體用的市售Bio-Glass的商品都已事先連接了氨烷基的商品都已事先連接了氨烷基(烷基胺烷基胺)。 用葡聚糖包被玻璃珠則可改善其親水性，并增加用葡聚糖包被玻璃珠則可改善其親水性，并增加化學(xué)活性基團(tuán)。用抗

20、原涂布的玻璃珠已成功地分化學(xué)活性基團(tuán)。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分離了免疫淋巴細(xì)胞，在離了免疫淋巴細(xì)胞，在DNA連接的玻璃珠上純化連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的了大腸桿菌的DNA和和RNA聚合酶。聚合酶。 載體載體pH范圍范圍交聯(lián)瓊脂糖交聯(lián)瓊脂糖纖維素纖維素葡聚糖葡聚糖硅膠硅膠玻璃玻璃聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺羥乙基異丁烯酸羥乙基異丁烯酸環(huán)氧乙烷環(huán)氧乙烷-丙烯酸聚合物丙烯酸聚合物苯乙烯苯乙烯-二乙烯苯聚合物二乙烯苯聚合物聚丙烯醇聚丙烯醇N-丙烯?；；?2-氨基氨基-2-羥甲基羥甲基-1,3-丙二醇丙二醇聚四氟乙烯聚四氟乙烯21411421488310212012113114111不受不受pH影

21、響影響五、親和配基五、親和配基 （一）配基的選擇（一）配基的選擇 配基與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力配基與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力 配基與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較配基與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性強(qiáng)的特異性 配基要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合配基要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合 配基自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性配基自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性 （二）配基的濃度（二）配基的濃度 （三）配基偶聯(lián)的位置（三）配基偶聯(lián)的位置 （四）配基分子的大小（四）配基分子的大小 （五）配基的類型（五）配基的類型 配基的濃度 在親和勢(shì)比較低的時(shí)候，增加配基濃度有利于吸在親和勢(shì)比較低的時(shí)候，增加配基濃度有利于吸附。附。

22、配基濃度太高容易使大分子配基上的活性中心互配基濃度太高容易使大分子配基上的活性中心互相遮蓋，反而使親和柱吸附力降低。相遮蓋，反而使親和柱吸附力降低。 配基濃度太高又會(huì)使吸附力太強(qiáng)，造成洗脫上的配基濃度太高又會(huì)使吸附力太強(qiáng)，造成洗脫上的困難；另外，隨著配基濃度的增加，非專一性吸困難；另外，隨著配基濃度的增加，非專一性吸附也增加，而專一性吸附卻降低。附也增加，而專一性吸附卻降低。 作為一個(gè)有效的吸附劑，理想的配基濃度為作為一個(gè)有效的吸附劑，理想的配基濃度為110 mol/L，并以，并以2 mol/L的凝膠為最好。的凝膠為最好。 配基偶聯(lián)的位置 在一般情況下，親和結(jié)在一般情況下，親和結(jié)合時(shí)配體分子與

23、配基分合時(shí)配體分子與配基分子僅有一部分發(fā)生相互子僅有一部分發(fā)生相互作用。作用。 為了保證親和吸附劑有為了保證親和吸附劑有足夠大的親和能力，我足夠大的親和能力，我們希望配基固定化時(shí)，們希望配基固定化時(shí)，其其不參與親和結(jié)合不參與親和結(jié)合的部的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。 配基分子的大小 制備親和柱時(shí)，應(yīng)首先選用制備親和柱時(shí)，應(yīng)首先選用大分子配基，大分子配基，因?yàn)樾》肿优浠晒┳R(shí)別、互補(bǔ)的特殊結(jié)因?yàn)樾》肿优浠晒┳R(shí)別、互補(bǔ)的特殊結(jié)構(gòu)較少，一旦偶聯(lián)到載體上后，這種識(shí)別構(gòu)較少，一旦偶聯(lián)到載體上后，這種識(shí)別的結(jié)構(gòu)更少。的結(jié)構(gòu)更少。 小分子配基時(shí)小分子配基時(shí)，由于酶的活性中心常是埋，由于酶的活性中

24、心常是埋藏在結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，它們與介質(zhì)的藏在結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，它們與介質(zhì)的空間障礙空間障礙影響其與親和配基的結(jié)合作用。影響其與親和配基的結(jié)合作用。 為了改變這種情況可在載體和配基間插入為了改變這種情況可在載體和配基間插入一個(gè)一個(gè)“手臂手臂” 以消除空間障礙，手臂的以消除空間障礙，手臂的長度是有限的，太短不能起消除空間障礙長度是有限的，太短不能起消除空間障礙的作用。太長往往使非特異性的作用如疏的作用。太長往往使非特異性的作用如疏水作用增強(qiáng)。水作用增強(qiáng)。 脂肪族二胺類化合物脂肪族二胺類化合物與瓊脂糖偶聯(lián)。與瓊脂糖偶聯(lián)。配基的類型配基的類型 根據(jù)配基對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將根據(jù)配基對(duì)待分離物質(zhì)的親和

25、性的不同，可以將其分為兩類：特異性配基（其分為兩類：特異性配基（specific ligand）和）和通用性配基（通用性配基（general ligand）。）。 特異性配基一般是指只與單一或很少種類的蛋白特異性配基一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。Eg:抗原和抗體、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素受體酶和它的抑制劑、激素受體 通用性配基一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一通用性配基一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配基，類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配基， eg:凝集凝集素、核酸素、核酸 第三節(jié)親和層析的操作過程第三節(jié)親和

26、層析的操作過程 一、基質(zhì)的活化一、基質(zhì)的活化 對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理 （一）多糖基質(zhì)的活化：溴化氰活化（一）多糖基質(zhì)的活化：溴化氰活化 、環(huán)、環(huán)氧乙烷基活化氧乙烷基活化 （二）（二） 聚丙烯酰胺的活化：甲酰胺基的修聚丙烯酰胺的活化：甲酰胺基的修飾飾 （三）（三） 多孔玻璃珠的活化多孔玻璃珠的活化 ：硅烷化試劑與：硅烷化試劑與玻璃反應(yīng)生成烷基胺玻璃玻璃反應(yīng)生成烷基胺玻璃 OHgelOH+CNBrgelOOCNH+RNH2gelOOHCNHNHR溴化氰活化溴化氰活化 gelORCHOCH2+ RNH2gelORCHH2COHNHRgelORCHOCH2+ ROHgelOR

27、CHH2COHOR環(huán)氧乙烷基活化環(huán)氧乙烷基活化 聚丙烯酰胺的活化聚丙烯酰胺的活化 二、間隔臂分子（手臂）二、間隔臂分子（手臂） 空間位阻效空間位阻效應(yīng)應(yīng) 加入一段有加入一段有機(jī)分子，使機(jī)分子，使基質(zhì)上的配基質(zhì)上的配體離開基質(zhì)體離開基質(zhì)的骨架向外的骨架向外擴(kuò)展伸長。擴(kuò)展伸長。 gelOOCNH+ NH2(CH2)nNH2gelOOHNHCNH(CH2)nNH2gelOOCNH+ NH2(CH2)nCOOHgelOOHNHCNH(CH2)nCOOH三、配基偶聯(lián)的方法三、配基偶聯(lián)的方法 （一）碳二亞胺縮合法（一）碳二亞胺縮合法 （二）酸酐法（二）酸酐法 （三）疊氮化法（三）疊氮化法 （四）重氮化法（

28、四）重氮化法 碳二亞胺縮合法碳二亞胺縮合法 酸酐法酸酐法 用-氨基烷基瓊脂糖(或丙烯酰肼衍生物)與1%的琥珀酸酐水溶液作用，生成琥珀酰氨烷基瓊脂糖衍生物(含羧基的載體)。 疊氮化法疊氮化法 重氮化法重氮化法 氨基烷基瓊脂糖衍生物，在pH9.3的硼酸鈉(或三乙胺)和40%(V/V)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，與對(duì)硝基苯疊氮化合物在室溫反應(yīng)1 h，制得對(duì)硝基苯甲酰胺烷基瓊脂糖衍生物。 產(chǎn)品先依次用50%DMF、25%DMF和水充分洗滌，接著用0.1 mol/L連二亞硫酸鈉在4050還原40 min，最后在0、0.5 mol/L HCl溶液中用0.1 mol/L亞硝酸鈉處理7 min，制得

29、重氮鹽衍生物。 將所需配基與該瓊脂糖重氮衍生物偶聯(lián)反應(yīng)，便可制得親和層析柱。 四、用于固定化配基的凝膠衍生物四、用于固定化配基的凝膠衍生物 Sepharose CNBr活化的Sepharose 4B AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 環(huán)氧活化型Sepharose 6B五、影響吸附劑親和力的幾個(gè)因素五、影響吸附劑親和力的幾個(gè)因素 微環(huán)境的影響微環(huán)境的影響 空間障礙的影響空間障礙的影響 配基濃度對(duì)親和力的影響配基濃度對(duì)親和力的影響 配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響 載體孔徑的影響載體孔徑的影響 （一）微環(huán)境的影響（一）微環(huán)境的影響 載體和載體和“手

30、臂手臂”的存在會(huì)引起離子交換作的存在會(huì)引起離子交換作用的發(fā)生，影響親和吸附劑的吸附特異性。用的發(fā)生，影響親和吸附劑的吸附特異性。 極性極性很低或無極性的基團(tuán)則由于疏水作用很低或無極性的基團(tuán)則由于疏水作用的存在，也會(huì)引起非特異性吸附作用。有的存在，也會(huì)引起非特異性吸附作用。有時(shí)則有助于親和力的提高，加強(qiáng)了親和層時(shí)則有助于親和力的提高，加強(qiáng)了親和層析的效果；析的效果； 配基與載體和配基與載體和“手臂手臂”氫鍵的相互作用氫鍵的相互作用可可能會(huì)使其強(qiáng)烈締合，從而妨礙了與配體的能會(huì)使其強(qiáng)烈締合，從而妨礙了與配體的親和結(jié)合。親和結(jié)合。 （二）空間障礙的影響（二）空間障礙的影響 有的親和對(duì)兩物質(zhì)間原有很高的

31、親和力，有的親和對(duì)兩物質(zhì)間原有很高的親和力，但當(dāng)其一方制成親和吸附劑時(shí)，與相應(yīng)配但當(dāng)其一方制成親和吸附劑時(shí)，與相應(yīng)配體的親和力可能完全喪失。體的親和力可能完全喪失。 這種現(xiàn)象對(duì)于親和力低的或分子量特大的這種現(xiàn)象對(duì)于親和力低的或分子量特大的親和對(duì)以及小分子配基更明顯。親和對(duì)以及小分子配基更明顯。 需要在載體與配基之間插入一段適當(dāng)長度需要在載體與配基之間插入一段適當(dāng)長度的的“手臂手臂” （三）配基濃度對(duì)親和力的影響（三）配基濃度對(duì)親和力的影響 對(duì)于低親和力系統(tǒng)，為了取得較好的配體對(duì)于低親和力系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。度。 較

32、高的配體濃度在親和層析時(shí)呈現(xiàn)較高的配體濃度在親和層析時(shí)呈現(xiàn)“累增累增效應(yīng)效應(yīng)”，即提高了親和吸附劑的吸附能力。，即提高了親和吸附劑的吸附能力。 （四）配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響（四）配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響 在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時(shí)，由于在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時(shí)，由于它們具有數(shù)個(gè)可供偶聯(lián)的功能基團(tuán)，必須它們具有數(shù)個(gè)可供偶聯(lián)的功能基團(tuán)，必須控制偶聯(lián)反應(yīng)的條件，使它以最少的鍵與控制偶聯(lián)反應(yīng)的條件，使它以最少的鍵與載體連接，這樣有利于保持蛋白質(zhì)原有的載體連接，這樣有利于保持蛋白質(zhì)原有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使親和吸附劑具有較大的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使親和吸附劑具有較大的親和能力。親和能力。（五）載體

33、孔徑的影響（五）載體孔徑的影響 載體的孔隙是配體向配基接近的運(yùn)動(dòng)通道。載體的孔隙是配體向配基接近的運(yùn)動(dòng)通道。所以載體的孔徑大小對(duì)吸附劑的親和能力所以載體的孔徑大小對(duì)吸附劑的親和能力有決定性影響。有決定性影響。 當(dāng)配基和大分子對(duì)象的親和力十分高當(dāng)配基和大分子對(duì)象的親和力十分高(如抗如抗原與抗體原與抗體)，或是配體是很大的顆粒，或是配體是很大的顆粒(如細(xì)胞如細(xì)胞器和完整細(xì)胞器和完整細(xì)胞)，載體的多孔性就顯得不很，載體的多孔性就顯得不很重要了，那是因?yàn)榕潴w與配基的作用僅發(fā)重要了，那是因?yàn)榕潴w與配基的作用僅發(fā)生在凝膠表面。生在凝膠表面。六、親和層析的基本操作六、親和層析的基本操作 親和吸附劑選擇制備親

34、和吸附劑選擇制備 上樣上樣 洗脫洗脫 親和吸附劑的再生和保存親和吸附劑的再生和保存 （一）上樣（一）上樣 上樣時(shí)應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括上樣上樣時(shí)應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括上樣流速、緩沖液種類、流速、緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度、溫度、離子強(qiáng)度、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。和吸附劑上。 上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質(zhì)。附劑上的雜質(zhì)。 （二）洗脫（二）洗脫 選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非