植物生理指標(biāo)檢測方法

1、植物組織中可溶性糖含量的測定在作為營養(yǎng)物質(zhì)主要是指可溶性糖和淀粉。它們在營養(yǎng)中的作用主要有：合成纖維素組成細(xì)胞壁；轉(zhuǎn)化并組成其他有機(jī)物如核苷酸、核酸等； 分解產(chǎn)物是其他許多有機(jī)物合成的原料，如糖在呼吸過程中形成的有機(jī)酸，可作為nh 3 的受體而轉(zhuǎn)化為氨基酸；糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過程和各種生命活動(dòng)提供了所需的能量。由于碳水化合物具有這些重要的作用，所以是營養(yǎng)中最基本的物質(zhì)，也是需要量最多的一類。蒽酮法測定可溶性糖一、原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定

2、量測定。該法的特點(diǎn)是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下， 用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此， 有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但在測定水溶性碳水化合物時(shí)，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，不然會(huì)因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外， 不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之， 半乳糖、甘露

3、糖較淺， 五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時(shí)，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時(shí)，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為620 nm ，故在此波長下進(jìn)行比色。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料任何植物鮮樣或干樣。（二）試劑1. 80 乙醇。2. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 g/ml ）：準(zhǔn)確稱取100 mg 分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至100 ml ，使用時(shí)再稀釋10 倍（100 g/ml ）。3 蒽酮試劑： 稱取 1.0 g 蒽酮，溶于80% 濃硫酸（將98% 濃硫酸稀釋， 把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中）1000 ml 中，冷卻至室溫，貯于

4、具塞棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，可使用2 3 周。（三）儀器設(shè)備分光光度計(jì)，分析天平，離心管，離心機(jī)，恒溫水浴，試管，三角瓶，移液管（5 、 1 、 0.5 ml ），剪刀，瓷盤，玻棒，水浴鍋，電爐，漏斗，濾紙。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 樣品中可溶性糖的提取稱取剪碎混勻的新鮮樣品0.5 1.0 g （或干樣粉末5 100 mg ），放入大試管中，加入15 ml 蒸餾水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷卻，過濾入100 ml 容量瓶中，用蒸餾水沖洗殘?jiān)鼣?shù)次，定容至刻度。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6 支大試管，從0 5 分別編號(hào)，按表24-1 加入各試劑。表 24-1 蒽酮法測可溶性糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號(hào)0

5、 1 2 3 4 5 100 g/ml 葡萄糖溶液（ml ）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸餾水（ml ）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒽酮試劑（ml ）5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 葡萄糖量（g ）0 20 40 60 80 100 將各管快速搖動(dòng)混勻后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷卻，在620 nm 波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量（g ）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 樣品測定取待測樣品提取液1.0 ml 加蒽酮試劑5 ml ，同以上操作顯色測定光密度。重復(fù)3 次。四、結(jié)果計(jì)算溶性糖含量（）從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖的量（g）

6、 提取液體積（ ml） 稀釋倍數(shù) /測定用樣品液的體積 (ml) 樣品重量 (g) 106 100式中：c 從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖量，g 。v t 樣品提取液總體積, ml 。v 1 顯色時(shí)取樣品液量，ml 。w 樣品重（g ）。植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測定植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。在研究每一種酶的作用時(shí)，常以比活（酶活力單位/mg 蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是研究酶活的一個(gè)重要項(xiàng)目。常用測定方法有l(wèi)owry 法和考馬斯亮藍(lán)g-250 染料結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)將分別介紹這兩種方法。1考馬斯亮藍(lán)法一

7、、 實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)g-250 測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)g-250 在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65 nm，后者在595 nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0-100 g/ml ） ，蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595 nm 波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)g-250 結(jié)合在 2 min 左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。二、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料小麥葉片或其他植物組織2.儀器

8、設(shè)備分光光度計(jì)， 離心機(jī)，研缽，25 ml 容量瓶 1 個(gè)，刻度吸管 0.5 ml 2 支，2 ml 1 支，10 ml試管 3 支。3.試劑(1)牛血清白蛋白配成1000 g/ml 和 100 g/ml。(2)考馬斯亮藍(lán)g-250：稱取 100 mg 考馬斯亮藍(lán)g-250 溶于 50 ml 90%乙醇中，加入85%（ w/v ）磷酸100 ml，最后用蒸餾水定容至1000 ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。(3)90%乙醇(4)磷酸（ 85%， w/v ）三、 實(shí)驗(yàn)步驟：1.可溶性蛋白的提取稱取新鮮植物葉片0.5 g 置于研缽中，加入5 ml 4oc 下預(yù)冷的濃度為50 mmol/l ，ph

9、 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10 ml 離心管中，在4 oc 冰箱中靜置10 min，于 15000 rpm/min 下冷凍離心 25 min，上清液即為過氧化物粗提液。4 oc 下保存?zhèn)溆谩?.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)0-100 g/ml 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 6 支試管， 按下表數(shù)據(jù)配制0-100 g/ml 血清白蛋白液各1 ml。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1 ml，分別放入 10 ml 具塞試管中， 加入 5 ml 考馬斯亮藍(lán)g-250 試劑， 蓋塞， 反轉(zhuǎn)混合數(shù)次， 放置 2 min 后，在 595 nm 下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制 0-100 g/ml血清白蛋白液管號(hào)1

10、2 3 4 5 6 100 g/ml牛血清蛋白量 (ml) 蒸餾水量 (ml) 蛋白質(zhì)含量 (mg) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.02 0.4 0.6 0.04 0.6 0.4 0.06 0.8 0.2 0.08 1.0 0 0.10 (2)0-1000 g/ml 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作另取 6支試管， 按表 10-2 數(shù)據(jù)配制0-1000 g/ml牛血清白蛋白溶液各1 ml。與步驟 （1）操作相同，繪出 0-1000 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制 0-1000 g/ml血清蛋白血液管號(hào)7 8 9 10 11 12 1000 g/ml 牛血清白蛋白（ml ）蒸餾水量 (ml) 蛋白質(zhì)含量 (mg

11、) 0 1.0 0 0.2 0.8 0.2 0.4 0.6 0.4 0.6 0.4 0.6 0.8 0.2 0.8 1.0 0 1.0 3.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定吸取樣品提取液0.1 ml（樣品提取見各酶活測定），放入具塞刻度試管中（設(shè)兩個(gè)重復(fù)管） ，加入 5 ml考馬斯亮藍(lán)g-250 試劑，充分混合，放置2min 后在 595 nm 下比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。四、 結(jié)果計(jì)算與分析樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g 鮮重） =式中c查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg） ；v提取液總體積（ml） ；a測定所取提取液體積（ml） ；w取樣量（ g） 。wavc葉綠素測定方法1、

12、 稱取剪碎葉片0.2g，放入容量瓶。2、 加 50ml 95% 的乙醇。3、 遮光浸提48-72 小時(shí)，中間搖晃一次。 （保證各批次浸提時(shí)間一致）4、 分光光度計(jì)測吸光值，三波長（649， 665，470） ，分別對應(yīng)葉綠素a、b 和其他?？瞻诪?5%乙醇。計(jì)算公式如下：ca=13.95*d665-6.88*d649 c 單位： mg/l 葉綠素 a=ca*0.05/2 葉綠cb=24.96*d649-7.32*d665 葉綠素 b=cb*0.05/2 c其他=(1000*d470-2.05*ca-114.8cb)/245 葉綠素其他=c其他*0.05/2 總?cè)~綠素含量為三者之和。一般葉綠素a

13、/b 為 3： 1 至 4： 1 選擇的波長不一樣，計(jì)算公式就不一樣，網(wǎng)上也有其他的波長方法，計(jì)算公式里的系數(shù)響應(yīng)也有差異。淀粉含量的測定原理淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，測定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖含量換算成淀粉含量(c6h12o6 )n ( c6h10o5) n + nh2o 糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再與蒽酮作用形成綠色絡(luò)合物，顏色的深淺與糖含量有關(guān)。在 625 nm 波長下的 od 值與糖含量成正比。由于蒽酮試劑與糖反應(yīng)的呈色強(qiáng)度隨時(shí)間變化，故必須在反應(yīng)后立即在同一時(shí)間內(nèi)比色儀器用具和試劑1.儀器用具： 移液槍、10ml 離心管、試管、50ml 容量瓶

14、、試管架、棕色瓶（ =500ml ） 、 螺口瓶（=500ml ） 、燒杯、移液管（連續(xù)加樣器）、離心機(jī)、分光光度計(jì)；2.試劑：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取0.1000g 蔗糖（分析純） ，于小燒杯中加水溶解，定容至100ml ，加 2-3 滴濃 h2s04，該溶液可長期保存；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確吸取1mg/ml 的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液5ml，加水定容量50ml，得到濃度為0.1mg/ml 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液；蒽酮溶液： 100mg 蒽酮溶于50ml 濃 h2s04（化學(xué)純）中，避光保存，當(dāng)天配制當(dāng)天使用；3mol/l naoh 溶液： 12g 氫氧化鈉溶于100ml 蒸餾水；3mol/l hcl 溶液： 25ml 濃

15、鹽酸與 75ml 蒸餾水混勻。測定方法1.植物淀粉相關(guān)溶液的提?。合驕y可溶性糖所剩殘?jiān)屑尤?ml 3mol/l 的鹽酸，在沸水浴中煮沸45 分鐘，取出冷卻，4000 轉(zhuǎn)/分離心 15 分鐘，取上清到50ml 容量瓶中，加入7ml 3mol/l naoh ，用蒸餾水定容到 50ml，作為待測樣品。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：吸取0.1mg/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按下表加入至11 支試管：0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.1mg/ml 葡糖 (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 蒸餾水 (ml) 2 0.9 0.8 0.7 0.6 0.

16、5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 葡糖濃度（ mg/ml ）0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 蒽酮試劑 (ml) 8.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 45水浴中顯色1015 分鐘， 625 nm 處測 od 值3.準(zhǔn)確吸取待測液1.0ml， 加蒽酮 4.0ml， 在 45水浴中顯色10-15 分鐘，各管在加入蒽酮試劑時(shí)要迅速，加完后用力振蕩混勻。4.取出后避光冷卻，在625 nm 處測 od 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到提取液中可溶性總糖含量。結(jié)果計(jì)算葡萄糖糖含量（%）=標(biāo)準(zhǔn)曲

17、線對應(yīng)含糖量 定容體積 100（樣品質(zhì)量 顯色吸取液體積 103）粗淀粉含量（%） =葡萄糖含量 0.9強(qiáng)酸溶液，注意安全超氧化物歧化酶 (sod)的測定一、 實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod， ec 1.15.1.1)普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(nbt) 在光下的還原作用來確定酶活性大小。在氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基o2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560 nm 處有最大吸收。而sod 可清除 o2，從而抑制了甲腙的形成。于是

18、光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性的大小。二、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1.材料小麥葉片或其他植物組織2.儀器設(shè)備高速離心機(jī)；分光分度計(jì)；微量進(jìn)樣器；熒光燈(反應(yīng)試管處理度為4000 lx)；試管或指形管數(shù)支。3.試劑(1)1.50 mmol/l 磷酸緩沖液 (ph 7.8)。(2)2.130 mmol/l 甲硫氨酸 (met) 溶液：稱1.9399 g met 用磷酸緩沖液定容至100 ml。(3)3.750 mol/l氮藍(lán)四唑 (nbt) 溶液：稱取0.06133 g nbt 用磷酸緩沖液定容至100 ml，避光保存。(4)4. 100 mol

19、/l edta-na2溶液：稱取0.03721 g edta-na2用磷酸緩沖液定容至1000 ml。(5)5. 20 mol/l核黃素溶液：稱取0.0753 g 核黃素用蒸餾水定容至1000 ml 避光存。三、 實(shí)驗(yàn)步驟：1.顯色反應(yīng)取 5 ml 指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另4 支為對照管，按表2 依次加入下列各溶液對照管用緩沖液代替酶液，蒸餾水 0.25 ml。將其中 2 支對照管置于暗處，其它置于4000 lx 日光下反應(yīng)20 min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，對照可能較淺。2.測定待反應(yīng)結(jié)束，以不照光的對照管做空白，依次測定其它各管的吸光值。表 2 各溶液顯色反應(yīng)用

20、量試劑 (酶) 用量 (ml) 終濃度 (比色時(shí) ) 0.05 mol/l 磷酸緩沖液1.5 130 mmol/l met 溶液0.3 13 mmol/l 750 mol/l nbt溶液0.3 75 mol/l 100 mol/l edta na2液0.3 10 mol/l 20 mol/l 核黃素0.3 2.0 mol/l 酶液/緩沖液（對照）0.1 對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.2 總體積3.0 四、 結(jié)果計(jì)算與分析已知 sod 活性單位以抑制nbt 光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算sod 活性。sod 總活性sod 比活力式中： sod 總活性以酶單位每克鮮重表示。比活

21、力單位以酶單位每毫克蛋白表示。ack 照光對照管的吸光度。ae 樣品管的吸光度。vt 樣品液總體積，ml。vt 測定時(shí)樣品用量，ml 。w 樣品鮮重， g。蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。五、 注意事項(xiàng)1.配好的 met 溶液須在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止met 活性損失。2.配好的 nbt 溶液須放入棕色試劑瓶，并在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止nbt 見光分解。3.配好的核黃素溶液須放入棕色試劑瓶避光保存。六、 思考題1.在 sod 測定中為什么設(shè)照光和暗中兩個(gè)對照管? 2.影響本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的因素是什么? 應(yīng)如何克服? vtwackvtaeackfwgu5.0)()(/蛋白質(zhì)含量總活性蛋白sodmgu)

22、(/實(shí)驗(yàn)六植物抗氧化酶活性的測定酶液的提取稱取新鮮植物葉片0.5 g 置于研缽中，加入5 ml 4oc 下預(yù)冷的濃度為50 mmol/l ，ph 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10 ml 離心管中，在4 oc 冰箱中靜置10 min，于 15000 rpm/min 下冷凍離心 25 min，上清液即為過氧化物粗提液。4 oc 下保存?zhèn)溆谩?過氧化氫酶 (cat)的活性測定植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而導(dǎo)致h2o2累積。 h2o2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除植物體內(nèi)的h2o

23、2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此， 植物組織中過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。一、 實(shí)驗(yàn)原理h2o2在 240 nm波長下有強(qiáng)吸收，過氧化氫酶(catalase, cat, ec 1.11.1.6) 能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度 (a240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測量吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。二、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料小麥葉片或其他植物組織2.儀器設(shè)備紫外分光光度計(jì)， 離心機(jī)，研缽，25 ml 容量瓶 1 個(gè)，刻度吸管 0.5 ml 2 支，2 ml 1 支，10 ml 試管 3 支，恒溫水浴鍋。3.試劑(1)0.2 mol/l ph7.8 磷酸緩沖

24、液 (內(nèi)含 1%聚乙烯吡咯烷酮)。(2)0.1 mol/l h2o2 (用 0.1 mol/l 高錳酸鉀標(biāo)定 )。三、 實(shí)驗(yàn)步驟：取 10 ml 試管 3 支，其中 2 支為樣品測定管， 1 支為空白管 (將酶液煮死 )，按表 1 順序加入試劑。表 1 紫外吸收待測樣品測定液配制表試劑 (酶) 管號(hào)s0s1s2粗酶液 (ml) 0.2 0.2 0.2 ph 7.8 磷酸緩沖液 (ml) 1.5 1.5 1.5 蒸餾水 (ml) 1.0 1.0 1.0 25 oc 預(yù)熱后， 逐管加入0.3 ml 0.1 mol/l 的 h2o2， 每加完 1 管立即計(jì)時(shí)， 并迅速倒入石英比色杯中，240 nm

25、下測定吸光度，每隔l min 讀數(shù) 1 次，共測4 min，待 3 支管全部測定完后，計(jì)算酶活性。四、 結(jié)果計(jì)算與分析以 1min 內(nèi) a240減少 0.1 的酶量為1 個(gè)酶活單位 ( )。過氧化氫酶活性式中： a240 as0 (as1+as2)/2。as0 加入煮死酶液的對照管吸光度。as1、as2 樣品管吸光度。vt 粗酶提取液總體積(ml) 。v1 測定用粗酶液體積(ml) 。fw 樣品鮮重 (g)。0.1 a240每下降0.1 為 1 個(gè)酶活單位 ( )。t 加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min) 。注意：凡在240 nm 下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對本實(shí)驗(yàn)有干擾。五、 注意事項(xiàng)1.試劑中的h

26、2o2的濃度對測定結(jié)果影響較大，要注意標(biāo)定的準(zhǔn)確性。2.緩沖液中必須加pvp，以防止酶活性降低。六、 思考題1.影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些？2. 超氧化物歧化酶 (sod)的測定七、 實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod， ec 1.15.1.1)普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(nbt) 在光下的還原作用來確定酶活性大小。在氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基o2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560 nm 處有最大吸收。而sod 可清除

27、o2，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性的大小。八、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1.材料小麥葉片或其他植物組織2.儀器設(shè)備高速離心機(jī)；分光分度計(jì)；微量進(jìn)樣器；熒光燈(反應(yīng)試管處理度為4000 lx)；試管或指形管數(shù)支。3.試劑(6)1.50 mmol/l 磷酸緩沖液 (ph 7.8)。(7)2.130 mmol/l 甲硫氨酸 (met) 溶液：稱1.9399 g met 用磷酸緩沖液定容至100 ml。(8)3.750 mol/l氮藍(lán)四唑 (nbt) 溶液：稱取0.06133 g nbt 用磷酸緩沖液定容至100 ml，避光

28、保存。(9)4. 100 mol/l edta-na2溶液：稱取0.03721 g edta-na2用磷酸緩沖液定容至1000 ml。(10) 5. 20 mol/l核黃素溶液：稱取0.0753 g 核黃素用蒸餾水定容至1000 ml 避光存。九、 實(shí)驗(yàn)步驟：fwtvvtagu11.0240min)/(3.顯色反應(yīng)取 5 ml 指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另4 支為對照管，按表2 依次加入下列各溶液對照管用緩沖液代替酶液，蒸餾水 0.25 ml。將其中 2 支對照管置于暗處，其它置于4000 lx 日光下反應(yīng)20 min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，對照可能較淺。4.測定待反應(yīng)

29、結(jié)束，以不照光的對照管做空白，依次測定其它各管的吸光值。表 2 各溶液顯色反應(yīng)用量試劑 (酶) 用量 (ml) 終濃度 (比色時(shí) ) 0.05 mol/l 磷酸緩沖液3 130 mmol/l met 溶液0.6 13 mmol/l 750 mol/l nbt溶液0.6 75 mol/l 100 mol/l edta na2液0.6 10 mol/l 20 mol/l 核黃素0.6 2.0 mol/l 酶液0.1 對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.5 總體積6.0 十、 結(jié)果計(jì)算與分析已知 sod 活性單位以抑制nbt 光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算sod 活性。sod 總活性s

30、od 比活力式中： sod 總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。ack 照光對照管的吸光度。ae 樣品管的吸光度。vt 樣品液總體積，ml。vt 測定時(shí)樣品用量，ml 。w 樣品鮮重， g。蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。十一、注意事項(xiàng)4.配好的 met 溶液須在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止met 活性損失。5.配好的 nbt 溶液須放入棕色試劑瓶，并在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止nbt 見光分解。6.配好的核黃素溶液須放入棕色試劑瓶避光保存。十二、思考題3.在 sod 測定中為什么設(shè)照光和暗中兩個(gè)對照管? 4.影響本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的因素是什么? 應(yīng)如何克服? 3過氧化物酶 (pod)

31、活性的測定一、 實(shí)驗(yàn)原理vtwackvtaeackfwgu5.0)()(/蛋白質(zhì)含量總活性蛋白sodmgu)(/過氧化物酶 (peroxidases, pod, ec 1.11.1.7)是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶， 它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等有密切關(guān)系，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，酶活性就會(huì)發(fā)生變化。在過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470 nm 處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測量 470 nm 的吸光度變化，測定過氧化物酶活性。二、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料小麥葉片或其他植物組織2.儀器設(shè)備分光光度計(jì)，研缽， 100 ml 容量瓶，吸管

32、，離心機(jī)。3.試劑(1)50 mmol/l 磷酸緩沖液ph 7.0。(2)過氧化氫：取30%的過氧化氫613 l 用蒸餾水定容至50 ml，備用。(3)含愈創(chuàng)木酚的混合液：取60.3 l 愈創(chuàng)木酚溶于50 mmol/l 磷酸緩沖液 (ph 7.0)的燒杯中，置于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，用磷酸緩沖液ph 7.0 定容至 200 ml，保存于冰箱中，備用。三、 實(shí)驗(yàn)步驟取光徑 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入水或磷酸緩沖液(ph 7.0) 50 l，反應(yīng)混合液2.9 ml 和過氧化氫 60 l ，作為對照，另1 只中加入酶液50 l( 如酶活性過高可稀釋之)

33、，反應(yīng)混合液2.9 ml 和過氧化氫60 l ，立即開啟秒表記錄時(shí)間，于分光光度計(jì)上測量波長470 nm 下吸光度值，每隔1min 讀數(shù)一次。四、 結(jié)果計(jì)算與分析以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以a 470/ming(fw) 表示之。也可以用每分鐘內(nèi)a470變化 0.01 為 1 個(gè)過氧化物酶活性單位(u)表示。過氧化物酶活性式中： a470 反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化。w 植物鮮重， g。vt 提取酶液總體積，ml。vs 測定時(shí)取用酶液體積，ml 。t 反應(yīng)時(shí)間， min。五、 注意事項(xiàng)1.愈創(chuàng)木酚的含量會(huì)影響測定結(jié)果，在配制愈創(chuàng)木酚溶液時(shí)，必須準(zhǔn)確量取。2.h2o2須準(zhǔn)確配制六、 思考題

34、1.在 pod 測定的過程中不設(shè)置對照對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有無影響？為什么？tvswvtagu01.0470min)/(淀粉酶活力的測定方法淀粉酶主要包括 -淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和r-酶，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是 -淀粉酶和 -淀粉酶。 -淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分 -1,4 糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、 -極限糊精和少量葡萄糖。 ca 2+能使 -淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸， ph 3.6 以下可使其鈍化。 -淀粉酶從非還原端作用于 -1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的 -1,6 鍵時(shí)停止。單

35、獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)物為麥芽糖和 -極限糊精。 -淀粉酶是一種巰基酶，不需要ca 2+ 及 cl 等輔助因子，最適 ph 偏酸，與 -淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，60 保溫 15min 可使其鈍化。通常提取液中 -淀粉酶和 -淀粉酶同時(shí)存在。可以先測定（ + ）淀粉酶總活力，然后在 60 加熱 15 min ，鈍化 -淀粉酶，測出 -淀粉酶活力，用總活力減去 - 淀粉酶活力，就可求出 - 淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5- 二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測定。還原糖作用于黃色的3,5- 二硝基水楊酸生成棕紅色的3- 氨基 -5- 硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。

36、以每克樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。1 酶活測定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 (見下表 ) 取 7 支 20 ml 具塞刻度試管 ,預(yù)先潔凈滅菌干燥 ,編號(hào),按表加入試劑。搖勻 ,至沸水浴中煮沸 5 min。 取出后流水冷卻 ,加蒸餾水定容至 20 ml,以 1 號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn) ,在 520 nm的波長下比色測定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。試劑1 2 3 4 5 6 7 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ ml ）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 h2o（ml）2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水楊酸（ml）2.0

37、2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麥芽糖含量（ mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 od520(2)粗酶液淀粉酶活力測定待測粗酶液的制備：發(fā)酵 24 h 后發(fā)酵液 4000 r/ min 離心 10 min,去除菌體，在上清液中加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析 2h，然后 5000r/min 離心 20min，得到初步純化的淀粉酶。表 1 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液成分表及od 測定值按以下順序操作：取預(yù)先潔凈滅菌干燥試管,編號(hào)。取粗酶液1 ml 于各只試管中，各只試管分別加入3ml蒸餾水，于 60水浴中預(yù)熱 5min，各加 1ml 2%的淀粉溶液檸檬

38、酸淀粉緩沖液同時(shí)在40水中預(yù)熱 5min， 取檸檬酸淀粉緩沖液1ml 加入試管中 ,于 40水浴中保溫 30min加入 1.5 ml 3,5-二硝基水楊酸 ,沸水中 5 min,加入氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),加蒸餾水至 20 ml。搖勻,用分光光度計(jì)測定 od520 nm 值。在上述條件下以單位體積樣品在30 min 釋放 1 mg 麥芽糖所需的酶量為一個(gè)麥芽糖單位表示酶活性。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量按下列公式計(jì)算酶活力酶活力測定公式：淀粉酶活力 =麥芽糖含量（ mg） 淀粉酶原液總體積（ ml）/所加淀粉質(zhì)量每個(gè)樣品按下表所示步驟操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支管中加入試劑的時(shí)

39、間間隔要絕對一致：表 2 樣品酶活力測定步驟反應(yīng)順序樣品（重復(fù)3個(gè)）樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白樣品稀釋液（ ml）1 1 0 蒸餾水0 0 1 60預(yù)熱 5min 依 次 加 入 淀 粉 溶 液（ml）1.5 1.5 1.5 混合 60保溫 30min 依 次 加 入 dns 試 劑（ml）1.5 1.5 1.5 混合 100煮沸 5min 加入 0.4mol/l naoh 溶液終止反應(yīng)加入蒸餾水至總體積（ml）20 20 20 反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4,000rpm 離心 10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在分光光度計(jì)520nm 波長處測定樣品空白（ a0）和樣品

40、溶液（ a）的吸光值， aa0為實(shí)測吸光值。用直線回歸方程計(jì)算樣品淀粉酶的活性。2 活性計(jì)算酶活力單位定義：在60、ph5.6 條件下，每小時(shí)從2的可溶性淀粉溶液中釋放出1mg爾麥芽糖的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（ u）淀粉酶活性 u 按下式計(jì)算：u = f 其中： u樣品淀粉酶活性， u/ml；k標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；f樣品溶液反應(yīng)前的總量，ml；s樣品測試量；表 1 中 s1ml； k（ aa0）s（ 3060） 180601 小時(shí)為 60min；30反應(yīng)時(shí)間， min。試劑(1)2% 淀粉溶液(2) 0.4mol/l 氫氧化鈉(3) ph5.6 檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g ，溶解后定容至

41、1000ml ，為 a 液。稱取檸檬酸鈉29.41g ， 溶解后定容至1000ml ， 為 b 液。 取 a 液 13.7ml 與 b 液 26.3ml 混勻，即為ph5.6 之緩沖液。(4) 精確稱取1g3,5- 二硝基水楊酸溶于20ml 1mol/l 氫氧化鈉中，加入50ml 蒸餾水，再加入30g 酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100ml ，蓋緊瓶塞，防止co2進(jìn)入。植物組織游離脯氨酸含量的測定原理：植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，

42、快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣 )限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后， 此縮合物在波長520nm 處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。材料、儀器設(shè)備及試劑1材料：植物葉片2儀器設(shè)備： 分光光度計(jì)； 水浴鍋： 漏斗：大試管 (20m1)；具塞刻度試管(20m1) 注射器或滴管 (5loml) 。3試劑：(1)3磺基水楊酸溶液(2)甲苯；(3)2.5酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mo1.l-l 磷酸以 3:2 混合，作為溶劑進(jìn)行配制，此液在4下 23 天有效 (4)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取25mg 脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至2

43、50ml，其濃度為100ug.ml-l 。再取此液10ml，用蒸餾水稀釋至looml ，即成 10gml-1 的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 （1） 取 7 支具塞刻度試管按表9.2-1 加入各試劑。 混勻后加玻璃球塞， 在沸水中加熱40min。(2)取出冷卻后向各管加入5ml 甲苯充分振蕩， 以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0 號(hào)管勻?qū)φ赵诓ㄩL 520nm 下比色。（3）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程921 各試管中試劑加入量試管0 1 2 3 4 5 6 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(m1) 0 02 04 08 1 2 16 20 水(m1) 2 18 1

44、6 12 0 8 04 0 冰乙酸 (m1) 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮顯色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3 樣品測定（1）脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻植物葉片0205g(干樣根據(jù)水分含量酌減)，分別置于大試管中，加入5m1 3磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 (2)取出試管， 待冷卻至室溫后， 吸取上清液2m1，加 2m1 冰乙酸和3m1 顯色液， 于沸水浴中加熱40min，下步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方法進(jìn)行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml 甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號(hào)管勻?qū)φ赵诓ㄩL520nm 下比色）。 (3)結(jié)果計(jì)算：

45、從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。脯氨酸 g.g -1(干或鮮重 )(c v) (a w)1 式中： c 一提取液中脯氨酸濃度(ps)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得： v 提取液總體積（ml） a - 測定時(shí)所吸取得體積（ml） w- 樣品重（ g）實(shí)驗(yàn)一植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測定法（elisa ）一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物激素的elisa 測定原理，掌握激素測定技術(shù)和樣品提取方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理免疫測定的方法是利用抗原、抗體特異性反應(yīng)而建立的，根據(jù)可視化方法的不同可分為：酶聯(lián)免疫、放射免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測定、生物發(fā)光免疫測定、濁度免疫測定法等。由于酶聯(lián)免疫吸附分析法（ enzym

46、e-linked immunosorbent assays, 簡稱 elisa ）具有靈敏性高且快速、簡便、成本低廉、無放射性污染等特點(diǎn)，而日益被廣泛應(yīng)用于植物激素測定。目前，幾大類植物激素iaa 、aba 、ga3、ga4、ipa、 zr 和 dhzr 等都建立了相應(yīng)的elisa 方法并有試劑盒出售。elisa 是建立在兩個(gè)重要的生物化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)之上的，即抗原和抗體反應(yīng)的高度專一性和敏感性；酶的高效催化特性。elisa 把這而這有機(jī)地結(jié)合在一起，即被分析物先與其相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，然后再檢測抗體或抗原上酶標(biāo)記物的活性，從而達(dá)到定性或定量測定的目的。elisa 根據(jù)均相、非均相以及競爭與非競

47、爭可分為非競爭固相免疫測定、非競爭均相免疫測定、競爭均相、競爭固相測定。常用的免疫測定均為非競爭固相和競爭固相免疫測定統(tǒng)稱為酶聯(lián)免疫吸附測定。所用的吸附載體為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶聯(lián)板以及硝酸纖維素膜（dot-elisa ）等。目前植物激素的酶聯(lián)免疫檢測方法有三種形式（見下圖）：直接法，間接法和簡化的間接法。直接法 是在固相載體上直接包被抗體（或先包被二抗， 再加一抗。 此為直接包被抗體的一種變通形式），利用游離抗原和酶標(biāo)抗原與吸附的抗體進(jìn)行競爭。ab+h+he=abh+abhe 其中 ab 表示抗體， h 表示游離激素，he 表示酶標(biāo)抗原。根據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)該反應(yīng)體系中ab 及he 的

48、量確定時(shí)，游離h 越多，abh 形成的就越多，而abhe 形成的就越少，即結(jié)合在板上的酶標(biāo)抗原就越少；反之游離h 越少，abh 形成的就越少，而abhe 形成的就越多，即結(jié)合在板上的酶標(biāo)抗原就越多。通過檢測酶的活性，就可以確定游離h 量的多少。間接法和簡化的間接法是包被抗原（間接法） 。利用游離抗原和吸附抗原與游離抗體進(jìn)行競爭。間接法是競爭后，再加入二抗標(biāo)記的酶，而簡化的間接法是在競爭的同時(shí)就加入二抗標(biāo)記的酶。ab+h+hp=abh+abhp 其中 ab 表示抗體，h 表示游離激素， hp 表示吸附在板上的激素蛋白質(zhì)復(fù)合物。根據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)該反應(yīng)體系中ab 及 hp 的量確定時(shí)，游離h 越

49、多， abh 形成的就越多，而abhp 形成的就越少，即結(jié)合在板上的抗體就越少；游離h 越少， abh 形成的就越少，而abhp 形成的就越多，即結(jié)合在板上的抗體就越多。而板上的抗體可以與二抗標(biāo)記的酶結(jié)合，檢測酶的活性，就可以確定游離h 量的多少。間接法直接法簡化間接法三、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料新鮮植物材料2.儀器設(shè)備研缽，冷凍離心機(jī)，氮?dú)獯蹈裳b置，酶聯(lián)免疫檢測儀，吸水紙，恒溫箱，冰箱，96 孔酶標(biāo)板，可調(diào)微量液體加樣器（10 l ， 40 l ，200 l ，1000 l ） ，帶蓋瓷盤（內(nèi)鋪濕紗布）。3.試劑(1)包被緩沖液： 稱取 1.5 g na2co3, 2.93 g nah

50、co3, 0.2 g nan3（可不加） , 用量筒加1000 ml 蒸餾水，ph 為 9.6。(2)磷酸鹽緩沖液（pbs） ：稱取 8.0 g nacl, 0.2 g kh2po4, 2.96 g na2hpo4 12h2o，用量筒加1000 ml 蒸餾水， ph 為 7.5。(3)樣品稀釋液：500 ml pbs 中加 0.1 ml tween-20，0.5 g 明膠（稍加熱溶解） 。(4)底物緩沖液：稱取5.10 g c6h8o7 h2o（檸檬酸）， 18.43 g na2hpo4 12h2o，用量筒加1000 ml 蒸餾水溶解，再加1 ml tween-20， ph 為 5.0。(5)

51、洗滌液： 1000 ml pbs 加 1 ml tween-20。(6)終止液： 2 mol/l 硫酸。(7)提取液： 80甲醇，內(nèi)含1 mmol/l bht( 二叔丁基對甲苯酚為抗氧化劑，先用100%甲醇溶解bht ，再配成 80%的濃度。否則bht 難溶解 )。(8)各激素包被抗原、各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和辣根過氧化物酶（hrp）標(biāo)記的二抗（間接和簡化間接酶免疫測定用試劑） 。各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和各激素酶標(biāo)物（直接酶免疫測定用試劑）。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 樣品中激素的提取(1)稱取 0.5-1.0 g 新鮮植物材料（若取樣后材料不能馬上測定，用液氮速凍后保存在-20的低溫冰箱中） ，加

52、2 ml 樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 ml 試管，再用2 ml 提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4冰箱中。(2)4下提取 4 h， 1000 g 離心 15 min( 實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)型號(hào)ldz5-2 ， 約 4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 ml提取液，攪勻，置4下再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢ァ?3)上清液過c-18 固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇（ 1 ml ）平衡柱 上樣 收集樣品 移開樣品后用 100%甲醇（ 5 ml）洗柱 100%乙醚（ 5 ml）洗柱 100%甲醇（ 5 ml）洗柱 循環(huán)。(4)將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入

53、5 ml 塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容（一?.5 g 鮮重用 1.5-3.0 ml 左右樣品稀釋液定容） 。2. 樣品測定(1)包被：在10 ml 包被緩沖液中加入一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽），混勻，在酶標(biāo)板每小孔中加100 l 。然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)，置于37下 3 h。(2)洗板：將包被好的板取出，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液，將下口瓶內(nèi)的洗滌液通過乳膠管均勻加入板上，使每孔充滿洗滌液，放置約0.5 min,再甩掉洗滌液。重復(fù)3 次，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。(3)競爭：即加標(biāo)準(zhǔn)物、待測樣和抗體。a

54、)加標(biāo)樣及待測樣：取樣品稀釋液0.98 ml，內(nèi)加 20 l激素的標(biāo)樣試劑（100 g/ml ）,即為 2000 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液，然后再依次稀釋1000 ng/ml, 500 ng/ml,250 ng/ml,125 ng/ml,62.5 ng/ml，31.25 ng/ml ，15.625 ng/ml ，0 ng/ml 。將系列標(biāo)準(zhǔn)樣加入96 孔酶標(biāo)板的前三行，每個(gè)濃度加3 孔，每孔 50 l ，其余孔加待測樣，每個(gè)樣品重復(fù)三孔，每孔50 l 。b)加抗體：在5 ml 樣品稀釋液中加入一定量的抗體（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽）,混勻后每孔加50 l ，然后將酶標(biāo)板加入濕盒內(nèi)開始競爭。c)競爭條

55、件37左右 0.5 h。(4)洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗滌液后要立即甩掉。然后再接著加第二次。目的是防止各孔的相互干擾。(5)加二抗：將一定量的酶標(biāo)二抗，加入10 ml 樣品稀釋液中（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽），混勻后，在酶標(biāo)板每孔加100 l ，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37下，溫育0.5 h。(6)洗板：方法同競爭之后的洗板（步驟4） ，洗五次，(7)加底物顯色：稱取10-20 mg 鄰苯二胺（ opd）溶于 10 ml 底物緩沖液中（小心勿用手接觸opd） ，完全溶解后加2-4 l 30% h202?；靹颍诿靠字屑?00 l （在暗處操作） ，然后放入濕盒內(nèi)，當(dāng)顯色適

56、當(dāng)后（即0 ng/ml 孔與 2000 ng/ml 孔的 od 差值約為1.0 左右時(shí)），每孔加入50 l 2 mol/l硫酸終止反應(yīng)。(8)比色：在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品492 nm 處的 od 值。五、 結(jié)果計(jì)算與分析1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線用于 elisa 結(jié)果計(jì)算最方便的是logit 曲線。曲線的橫坐標(biāo)用激素標(biāo)樣各濃度（ng/ml ）的自然對數(shù)表示，縱坐標(biāo)用各濃度顯色值的logit 值表示。 logit 值的計(jì)算方法如下：b/b0b logit （ b/b0）=ln =ln1-b/b0b0-b 其中 b0是 0 ng/ml 孔的顯色值， b 是其它濃度的顯色值。作出的l

57、ogit 曲線在檢測范圍內(nèi)應(yīng)是直線。待測樣品可根據(jù)其顯色值的logit 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出所含激素濃度（ng/ml）的自然對數(shù)，再經(jīng)過反對數(shù)即可知其激素的濃度（ng/ml） 。2. 含量計(jì)算求得樣品中激素的濃度后，樣品中激素的含量（ng/gfw）可用下式計(jì)算：n v2 v3 b a = v1 w 其中， a 表示激素的含量（ng/gfw ） ；v2表示提取樣品后，上清液的總體積；v1表示進(jìn)行真空濃縮干燥的上清液體積；（當(dāng)提取的上清液全部進(jìn)行真空濃縮干燥時(shí)v1與 v2的體積是相等的）v3表示真空濃縮后用樣品稀釋液定容的體積；w 表示樣品的鮮重；n 表示樣品中激素的濃度（ng/ml） ；b 表示樣

58、品的稀釋倍數(shù)（樣品稀釋液定容以后的稀釋倍數(shù)）。無菌技術(shù)與微生物分離培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)室的主要儀器和常用器皿介紹1主要儀器天平、光學(xué)顯微鏡、 干熱滅菌用電烘箱、 高壓蒸氣滅菌鍋、 培養(yǎng)箱、冰箱、搖床、離心機(jī)、分光光度計(jì)、 ph 計(jì)、水浴鍋、細(xì)菌過濾器、磁力攪拌器等。2常用玻璃器皿試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管、量筒、漏斗、燒杯、燒瓶、試劑瓶、滴瓶、干燥器、載玻片、蓋玻片3.其它器具接種環(huán)、接種針、接種鉤、試管架、鋁鍋、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精燈、硅膠塞、濾紙、 ph 試紙、紗布、棉花、包扎繩。二、普通光學(xué)顯微鏡觀看細(xì)胞示范光學(xué)顯微鏡可分辨大于0.2um 的物體，有一定的適用范圍。如果有更高的實(shí)

59、驗(yàn)要求可以選擇掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡。（附觀察到的細(xì)胞視野圖片）三、器具洗滌與干燥1、洗滌劑a.肥皂、洗潔精、洗衣粉是很好的去污劑，用于除去器皿上沾有的少量油脂。去污粉含有碳酸鈉、碳酸鎂，具有起泡和除油垢作用；硼砂增加了摩擦作用，使去污能力增強(qiáng)。b.重鉻酸鹽洗滌液，是一種強(qiáng)氧化劑，去污能力很強(qiáng)，常用來洗去玻璃和瓷質(zhì)器皿上的有機(jī)物。c.酸堿洗滌劑1)稀釋 3 倍的鹽酸。除去鐵銹、碳酸鋇、鈣鹽及其他金屬氧化物污污痕。2)稀釋 3 倍的硝酸。用于塑料器皿和沾污硝酸銀器皿的洗滌。3)5.0g 乙二酸溶于 100ml10%的硫酸溶液，經(jīng)加熱可洗去盛過高錳酸鉀的容器內(nèi)壁上的棕色二氧化錳。4)堿性乙醇溶液。 用 30%氫氧化鈉和等體積乙醇配制而成，用于清洗有油垢的玻璃器皿和瓷質(zhì)器皿。具有強(qiáng)腐蝕性，使用時(shí)小心。d.其他有機(jī)洗滌劑常