單克隆抗體技術的應用

1、第三節(jié)單克隆抗體技術的應用幾十年以來 , 人們一直嘗試利用人免疫系統(tǒng)產生人源性單抗來制備特異性強的人源抗體藥物 , 從而治療腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。根據(jù)用途的不同，單抗大體上可分為三類，即診斷用單抗、治療用單抗、“生物導彈 ”用單抗。單抗為人類疾病的防治和診斷、腫瘤體內定位、靶向藥物的制備、防止移植物的排異反應、新型疫苗的研制提供了較為理想的手段。3.1 用于疾病的診斷1、檢測淋巴細胞表面分子，用于鑒別淋巴細胞。它用于區(qū)分細胞亞群和細胞的分化階段的淋巴細胞。例如檢測 CD系列標志，有利于了解細胞的分化和 T 細胞亞群的數(shù)量和質量變化，這對多種疾病診斷具有參考意義。細胞表面抗原的檢測

2、，將對白血病患者的疾病分期、治療效果、預后判斷等方面有指導作用。組織相容性抗原檢測是移植免疫學的重要內容，應用單抗對其進行位點檢測可得到更可信的結果。人體內的淋巴細胞分為 T 細胞、 B 細胞和包括 NK細胞為代表的第三群細胞，下分若干亞群，各有其特異的表面標志和功能，據(jù)此建立許多相應的檢測方法。臨床上各種類型的免疫缺陷癥、自身免疫病以及腫瘤等均可出現(xiàn)不同群淋巴細胞數(shù)量和功能的變化。因此計數(shù)外周血和組織內淋巴細胞及其亞群的數(shù)目或比例，以及它們所顯示的功能強弱，可藉此判斷機體的細胞免疫水平，對臨床認識疾病，探討其發(fā)病機制、觀察病情、判斷預后、考核療效以及防治疾病等方面可提供極為有用的信息。檢測人

3、 T 細胞的特異性抗原，曾采用抗人腦、抗人胸腺細胞和抗人 T 細胞等抗血清，通過細胞毒試驗或免疫熒光染色加以鑒定。自抗白細胞分化抗原的單克隆抗體問世以來，上述諸多方法均被新方法取而代之。常用以鑒定和檢測計數(shù) T 細胞的表面分化抗原如下表所示。表T胞表面主要 CD抗原及其特異性用單克隆抗體檢測T 細胞表面抗原的方法有兩大類，一類是用標記抗體著染，如免疫熒光法、酶免疫法、生物素親和素（或鏈霉親和素）系統(tǒng)的 ABC 法以及免疫金銀染色法；另一類是用抗體致敏的紅細胞作花環(huán)試驗。兩類方法各有優(yōu)缺點。以下敘述有代表性的方法。（一）間接免疫熒光法本法是將分離獲得的外周血單個核細胞分別與抗相應CD的單克隆抗體

4、（如CD2、 CD4、CD8）結合后，洗去游離的抗體，繼加熒光素標記的抗小鼠IgG 抗血清，經(jīng)溫育結合后，洗去多余的標記抗體，取樣制片，用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)約 200 個單個核細胞，以熒光陽性細胞與計數(shù)細胞總數(shù)之比，求得相應CD抗原陽性的 T 百分率。如有條件，細胞經(jīng)熒光標記抗體著染后，用流式細胞儀計數(shù)，快速而準確，但需要較多的投資，難以普及應用。（二）免疫細胞化學法通常用酶免疫檢測法，如 APAAP酶免疫橋聯(lián)法。為減少非特異性著染，可選用生物素鏈霉親和素系統(tǒng)試劑作 ABC法染色。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡呈棕黃色的細胞為相應 CD抗原陽性細胞，計其占總淋巴細胞的百分率。本法簡便易行，不

5、需特殊儀器，一般試驗室均可采用。（三）抗體致敏細胞花環(huán)法用相應的 CD單克隆抗體致敏醛化的紅細胞作為指示物，它與受檢的細胞混勻后，置室溫片刻，繼經(jīng)低速離心，移放室溫作短期溫育或 4過夜后，重懸取樣涂片染色鏡檢。凡受檢細胞周圍粘附有 3 個或更多紅細胞的判為花環(huán)形成細胞如下圖所示，共計數(shù) 100200 個細胞，以花環(huán)形成數(shù)與計數(shù)細胞總數(shù)之比為相應 CD抗原陽性細胞的百分率。本法需有相應的致敏紅細胞試劑，受影響的因素較前兩法多。圖顯微鏡下的花環(huán)2、鑒定病原體，準確診斷感染性疾病。將病原體的抗原分離 , 再同骨髓瘤細胞雜交建立相應的雜交瘤細胞株, 分泌氨基糖甙類抗生素、維生素測定。單克隆抗體 , 可

6、以同病原體發(fā)生特異性的抗原 - 抗體反應 , 通過免疫熒光試驗或 ELISA 試驗對疾病進行診斷。例如轉鐵蛋白、腎素、甲狀腺素 (T4) 、三碘甲狀腺素 (T3) 、干擾素、補體成分 C3、cAMP、cGMP、生長素、絨毛膜促性腺激素(HCG)、促性腺激素 (FSH)、胰島素、 IgG、 IgE 、地高辛、氨茶堿、苯巴比妥、B12 等單抗均可作為體內激素或藥物等微量成分的如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、 EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨特優(yōu)勢。3、

7、腫瘤的診斷和分型。某些單抗具有在腫瘤部位蓄積的特性，可用于腫瘤的診斷。目前已批準使用的診斷劑有 : 用于結腸癌的 votomab 和 arcilumonab, 用于探測感染部位的 sulemab, 用于卵巢癌的 igovomab, 用于黑色素瘤的 tecnemab K- 1。例如： 劉瑞振等成功地制備了抗人 DcR3 McAb，未來對于肺癌、胃腸道腫瘤、腦惡性膠質瘤和胰腺癌的診斷具有很大的幫助。目前，對腫瘤相關抗原 ( 如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原 ) 的單抗早就用于臨床檢驗。隨著淋巴細胞雜交瘤技術的應用，許多抗人腫瘤標記物的雜交瘤細胞株已經(jīng)建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)

8、展，了解腫瘤細胞的生物學活性及其定量研究奠定了基礎。用抗腫瘤單抗檢查病理標本，可協(xié)助確定轉移腫瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標記單抗可用于體內診斷，再結合 X- 線斷層掃描技術，可對腫瘤的大小及其轉移灶作出定量診斷。4、機體微量成分的測定。應用單抗結合其它技術，可對機體的多種微量成分進行測定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原 - 抗體反應的特異性而建立起來的方法，它可以測至 10-9 10-12g ，使原來難以測定的激素能夠進行定量分析。這種激素類單抗可用于測定體內激素水平，判斷內分泌的功能狀態(tài)。除了激素，還可檢測諸多酶類、維生素、藥物和其它生化物質。這對受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出

9、、指導診斷和臨床治療均具有實際意義。3.2 用于疾病的治療1、抗腫瘤單抗 , 可用于腫瘤的導向治療。抗腫瘤單抗利妥昔單抗（ rituximab ） ( 美羅華 ) 是第一個被批準用于臨床治療的單抗 ; 它是一種針對 CD20 抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體 , 進入人體后可與 CD20特異性結合導致 B 細胞溶解 , 從而抑制 B 細胞增殖 , 誘導成熟 B 細胞凋亡 , 但不影響原始 B 細胞。隨后上市的適用于乳腺癌治療的曲妥珠單抗為一種針對 HER22/neu 的重組人源化 IgG 單克隆抗體 , 能特異性識 Her22 調控的細胞表面蛋白 HER22,使其通過內吞噬作用離開胞膜進入核體內 ,

10、 抑制其介導的信號轉導 , 從而起到治療腫瘤的作用。表 抗體類藥物及其靶分子而阿倫珠單抗（ Alemtuzumab）是人源化、非結合型單抗 , 作用靶點為正常與異常 B 淋巴細胞的 CD52 抗原 , 對源于 B 和 T 細胞的各種惡性腫瘤具有很好的治療作用。西妥昔單抗（ Cetuximab）和貝伐單抗（如下表所示其獨特的作用機理）是針對大腸癌的治療。曲妥珠單抗在乳腺癌的治療中起著重要的作用 ; 西妥昔單抗已被證實它對頭頸部癌，非小細胞肺癌和結腸癌等多種腫瘤有效。最新發(fā)表的 EXTREME（愛必妥）一線治療復發(fā)、轉移性頭頸部癌的研究表明，采用西妥昔單抗聯(lián)合順鉑或卡鉑 +氟尿嘧啶作為一線治療方案

11、，患者的總生存期（ OS）及無進展生存期（ PFS）均顯著延長如下圖所示。美國 Genentech 和 Biogen Idec 公司宣布 2011 年 1 月 28 日美國食品和藥品監(jiān)督管理局 (FDA)批準美羅華（ Rituxan ，rituximab ，利妥昔單抗 ) 作為對初始治療用美羅華加化療 ( 誘導治療 ) 有療效的晚期濾泡淋巴瘤一種維持治療如下圖所示。美羅華（ Rituxan ，rituximab），利妥昔單抗圖 EXTREME研究單純化療組和化療 +西妥昔單抗組的OS圖 EXTREME研究單純化療組和化療 +西妥昔單抗組的PFS貝伐單抗獨特的作用機制2、抗細胞表面分子單抗 ,

12、可抑制同種免疫反應主要用于移植排斥反應的防治?？谷?T 淋巴細胞單抗 (McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應。其作用機理有賴于 McAb的種類及其免疫學特性。注射抗小鼠 Thy-1 抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應。此外，對用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T 細胞單抗加補體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。如莫羅單抗 (muromonab-CD3, CD3-單克隆抗體， Orthoclone ， OKT3)是 FDA批準用于腎移植患者防止異體排斥反應的第一個鼠源型 McAb。此外，人 - 鼠嵌合抗體 Basiliximab

13、 、人源化 McAb Daclizumab 在器官移植排斥反應的治療上也取得了良好的效果。莫羅單抗 (muromonab- CD3, CD3-單克隆抗體， Orthoclone ，OKT3)3、單克隆抗體在其它疾病中的應用單克隆抗體藥物不只在腫瘤的治療中取得了很好療效 , 在其他疾病的治療中也取得了一些療效 , 例如 : 奧馬珠單抗 (omalizumab) 通過與游離 IgE 結合而顯著降低游離 IgE 的水平 , 阻斷 IgE 與肥大細胞、嗜堿粒細胞結合 , 防止炎癥介質的釋放?？娠@著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質量 , 減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù) , 減少糖皮質激素的用量 , 使用安全

14、, 具有很好的耐受性。 Mab03.2C1C2 在體外能抑制白念珠菌芽管的形成 , 從而抑制白念珠菌對上皮細胞、內皮細胞的粘附 , 降低白念珠菌的侵襲力。圖奧馬珠單抗治療慢性蕁麻疹奧馬珠單抗（ Omalizumab)是人源化 DNA單克隆抗體，具有：選擇性與血液中游離 IgE 結合，阻斷 IgE 與 FcRI 或 FcRII結合，從而阻斷肥大細胞或嗜堿性粒細胞釋放組胺；當游離 IgE 濃度降到 “0' 時，能下調嗜堿性粒細胞或肥大細胞表面 FcR I 的表達，降低效應細胞對過敏原的反應性； IgE奧馬珠單抗復合物在循環(huán)和組織中積聚，對新進入的過敏原分子具有清道夫的作用; 馬珠單抗與表達

15、 IgE 受體的 B 細胞結合，抑制抗原遞呈。近年來，奧馬珠己被 FDA批準用于治療成人中重度持續(xù)性過敏性哮喘和12歲以上兒童患者，對過敏性關節(jié)炎和類似抗IgE 復合物引起的疾病。 BluneJW等首先報告 1 例患有中等度持續(xù)性哮喘、結節(jié)病伴有復發(fā)性水腫8年的 61歲高家索患者，經(jīng)過奧馬珠治療后血管水腫很快意外消失。SpeclDrSL等報告 3 例經(jīng)傳統(tǒng)方法不能控制的慢性蕁麻疹患者，其中1 例 IgE 水平低下，抗 IgE 受體的抗體水平升高； 1 例 IgE 水平升高但抗 IgE 受體的抗體水平正常；另 1 例 IgE 水平非常高，抗 IgE 受體的抗體水平也高。 3 例均按推薦方案給藥，

16、結果： 2 例在治療 1 周后癥狀完全消失，另 1 例在 6 周內消失，治療后異常的抗 IgE 受體的抗體水平均恢復正常。 Sha iro CA等報告 6 例嚴重性蕁麻疹伴有或不伴有水腫病例，這些患者或者對免疫抑制劑無效或者拒絕，按照哮喘的方法和劑量給藥，間隔時間依據(jù)蕁麻疹或水腫的復發(fā)情況而定， 5/6 的患者在治療 1 周內所有癥狀被控制，逐漸停用其它藥物， 1 例無效，絕大多數(shù)患者在 6 個月后停藥無復發(fā)。另有研究顯示 , 輸注英夫利昔單抗（ Infliximab ）可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、關節(jié)炎病人的關節(jié)和皮損癥狀。圖幼年脊柱關節(jié)病使用英夫利昔單抗又如單抗 8H8 一種抗登革熱病毒

17、核衣殼蛋白(C 蛋白 )的單抗對登革熱病和登革熱出血熱 / 失血性休克綜合征的早期診斷和治療均有一定效果。在艾滋病的治療上，利用基因工程手段制備的中和抗體F425-B4e8(B4e8)，可以中和艾滋病病毒 1 上的抗原表位，阻止艾滋病病毒1 對人體正常組織的感染。對自身免疫性疾病的治療，單抗藥物能夠與黏附分子、激活標記、抗原或受體靶分子結合，能在分子水平上調節(jié)免疫病理反應，從而干擾炎性反應的發(fā)生。還有治療感染性休克和膿毒血癥的單抗，個別也有治療類風濕性關節(jié)炎、型糖尿病和腸炎的單抗。此外，還有臨床試用于預防器官移植抗排異反應、抗血小板凝集和艾滋病的單抗。3.3 抗腫瘤單抗偶聯(lián)物（生物導彈）抗腫瘤

18、單抗耦聯(lián)物免疫耦聯(lián)物分子由單抗與兩部分構成?？捎米?“彈頭 ” 的物質主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素 ; 與單抗連接分別構成放射免疫耦聯(lián)物、化學免疫耦聯(lián)物和免疫毒素。此外 , 酶結合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結合單抗偶聯(lián)物也已進入腫瘤治療的研究范疇。單抗靶向治療作用方式（一）、直接作用：通過抗體依賴性細胞介導細胞毒（ADCC）、補體依賴細胞毒（ CDC）的細胞溶解效應殺傷腫瘤細胞。（二）、間接作用：單抗作為靶向載體，偶聯(lián)細胞毒藥物（放射性核素、化療藥物、毒素等）。靶向腫瘤后利用細胞毒殺傷腫瘤細胞。放射免疫治療的作用機理主要是間接作用。1、免疫偶聯(lián)物放射免疫治療(RIT)放射免疫耦聯(lián)物放射性免疫耦

19、聯(lián)物是以單克隆抗體為載體 , 以放射性核素為彈頭 , 通過抗體特異性結合腫瘤細胞相關抗原 , 將產生高能射線的放射性核素靶向到腫瘤細胞 , 借助放射性同位素的電離輻射效應殺傷腫瘤細胞或抑制其生長，同時又降低對正常組織的放射性損傷。實現(xiàn)對腫瘤的近距離內照射治療。 RIT 利用攜帶放射性核素的單克隆抗體特異地結合到病灶部位 , 減少了對正常組織的損傷。如在前列腺癌治療中應用最廣泛的抗前列腺特異性膜抗原的單抗 , 其 CYT- 356 為最早制備的一種單抗。圖 放射免疫治療圖 131I-腫瘤細胞核人鼠嵌合單抗腦膠質瘤免疫導向放療2、免疫毒素免疫毒素是用化學方法或基因工程方法將腫瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價連接而成的腫瘤治療藥物。免疫毒素可與腫瘤細胞表面受體或與細胞表面的靶抗原相結合后內化 , 繼而在胞內抑制細胞蛋白質合成 , 導致腫瘤細胞死亡。毒素有很多種 , 如植物毒素、細菌毒素、動物毒素。國內上海將肺癌單抗與蓖麻毒素、相思子毒素和抗癌藥如阿霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤等偶聯(lián)成功。圖針對 CD25的免疫毒素3、化學免疫偶聯(lián)物單抗化學免疫耦聯(lián)物單抗與藥物耦聯(lián)物對腫瘤靶細胞顯示選擇性殺傷作用，它是藥物良好的靶向性載體,