微生物發(fā)酵制檸檬酸論文

1、微生物發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸摘要：檸檬酸是一種十分重要的化學(xué)物質(zhì)，常用于食品和飲料以及醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑以及工業(yè)領(lǐng)域。目前其主要通過微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，是微生物在工業(yè)上應(yīng)用的代表。關(guān)鍵詞：檸檬酸 黑曲霉 TCA循環(huán) 糖酵解 表面發(fā)酵 固體發(fā)酵作者：正文：檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸，學(xué)名-羥基丙烷三羧酸，化學(xué)名稱2-羥基丙三羧酸，分子式為C6H8O7，是生物體重要的代謝產(chǎn)物之一，在自然界中廣泛存在，在植物葉子和果實(shí)中尤以檸檬、柑橘、梅、李、梨、桃等植物果實(shí)中，在動(dòng)物的骨骼、血液、乳汁、唾液、汗液和尿中以游離檸檬酸狀態(tài)或以金屬鹽形式存在。商品檸檬酸為無色半透明晶體，或白色顆粒或白色結(jié)晶性

2、粉末，無臭，雖有強(qiáng)烈酸味但令人愉快，稍有一點(diǎn)后澀味。生產(chǎn)研究歷史：早在1784年，瑞典化學(xué)家Scheel就首次從檸檬汁中提取出了檸檬酸，直到上世紀(jì)初，這種有機(jī)酸仍然絕大多數(shù)是從檸檬中提取出來的。1860年，意大利開始用向果汁中加石灰乳方法制檸檬酸，從而進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，以意大利的西西里島最著名。1891年，德國科學(xué)家Wehmer就從腐敗的柑橘中分離出一種絲狀菌，能使含鈣的糖液變酸，并從中分離出檸檬酸和草酸。1913年，Zahorski首先利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸，1919年和1923年，比利時(shí)的一家公司和美國的Ch. Pfizer公司分別成功進(jìn)行淺盤發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。后于1952年，美國Mil

3、es公司首先采用深層發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸，并在世界上流行至今。我國檸檬酸工業(yè)解放前是空白，1967年黑龍江平糖建立了我國第一個(gè)生產(chǎn)100噸的檸檬酸工廠（以甜菜糖蜜為原料，采用淺盤發(fā)酵和鈣鹽-離子交換法提取工藝）。1968年，用薯干為原料，采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的上海酵母廠投產(chǎn)成功。以薯干粉為原料、深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸，形成了我國生產(chǎn)檸檬酸的一大特色。1990年，上海市工業(yè)微生物研究所完成國家七五攻關(guān)項(xiàng)目篩選出860菌種，發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)20%，處于世界領(lǐng)先水平。我國檸檬酸行業(yè)從產(chǎn)量上位居世界第一，從技術(shù)上，在國際上也處于領(lǐng)先水平，優(yōu)勢在于：我國的檸檬酸發(fā)酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能，淀粉原

4、料被液化后，即可進(jìn)行發(fā)酵，不需將淀粉水解成葡萄糖；盡管采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝，但發(fā)酵周期只有64h；檸檬酸產(chǎn)酸速度大大高于國外水平，平均產(chǎn)酸率是國外的2倍。用處：我國檸檬酸主要消費(fèi)于食品和飲料市場，其他消費(fèi)領(lǐng)域包括醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑以及工業(yè)領(lǐng)域。發(fā)酵原料：幾乎含淀粉和可發(fā)酵糖的農(nóng)產(chǎn)品、農(nóng)產(chǎn)品加工品及其副產(chǎn)品，某些有機(jī)化合物以及石油中的某些成分都可以采用。目前，檸檬酸生產(chǎn)工業(yè)上使用的原料主要有以下幾類：淀粉質(zhì)原料 甘薯、木薯、馬鈴薯及其薯干、薯粉、淀粉及薯渣及玉米粉等。粗制糖類 粗蔗糖、水解糖、飴糖等。制糖工業(yè)副產(chǎn)品 糖蜜、葡萄糖母液、冰糖母液等。含正烷烴（主要是10-20碳） 較多的石油餾分

5、。副原料 米糠、麥芽、營養(yǎng)鹽類、消泡劑類以及各種產(chǎn)酸促進(jìn)劑。幾種深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下（按1t培養(yǎng)基計(jì)）：a. 蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖200kg NH4NO3 1.1kgKCl（1mol/L） MgSO4·7H2O 0.25kgHCl（1mol/L） 10L水加至1tb. 水解糖發(fā)酵培養(yǎng)基：還原糖 170-180kg NH4NO3 2.5kgKH2PO4 0.3kg MgSO4·7H2O 0.25kgpH 3.5 加水至1tc. 糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基：處理后的糖蜜含糖250g/L左右，pH6.8-7.0d. 薯干發(fā)酵培養(yǎng)基：薯干粉220kg-280kg液化后加水至1t，pH自然發(fā)酵

6、微生物：能夠產(chǎn)生檸檬酸的微生物有很多，在石油原料發(fā)酵中主要使用酵母菌，特別是解脂假絲酵母和涎沫假絲酵母，但在工業(yè)生產(chǎn)上，以糖質(zhì)或淀粉質(zhì)原料直接發(fā)酵的主要是曲霉屬，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、米曲霉、灰綠曲霉最為重要，特別是黑曲霉。微生物的育種：（1） 為提高葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的代謝活力，進(jìn)一步增強(qiáng)EMP的代謝流，采用60Co射線或EMS等誘變劑誘變育種（致死率為70%-80%）。通過高糖（蔗糖）14%的培養(yǎng)基平板篩選分離出比原株生長更好的突變株，有可能獲得己糖激酶和6-磷酸果糖激酶活性更高的菌株；在纖維二糖培養(yǎng)基的平板篩選具有2-脫氫葡萄糖抗性的突變株，有可能獲得以淀粉為原料的高產(chǎn)檸檬酸突變株；亦可進(jìn)一

7、步選育抗金屬錳離子、鋅離子能力強(qiáng)的突變株。（2） 為降低副產(chǎn)物有機(jī)酸如葡萄糖酸和草酸的能力，采用基因工程的手段，構(gòu)建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶喪失的工程菌。生物合成途徑：普遍認(rèn)為檸檬酸糖質(zhì)原料發(fā)酵是經(jīng)EMP途徑、丙酮酸羧化和三羧酸循環(huán)而形成的。1954年，Shu提出葡萄糖80%經(jīng)EMP途徑代謝。雖然也存在HMP酶系，但HMP途徑主要在孢子階段活躍，應(yīng)為它提供了核酸合成等所需的前體物質(zhì)。Shu的研究表明約有40%的檸檬酸是通過檸檬酸循環(huán)中的二羧酸形成的。Cleland等則認(rèn)為TCA循環(huán)受到強(qiáng)烈干擾。還有一種意見認(rèn)為，當(dāng)烏頭酸酶和異擰香酸脫氫酶消失時(shí)，就出現(xiàn)檸檬酸。而有人卻證明檸檬酸酶或需要NA

8、D和NADP的異檸檬酸脫氫酶受到阻斷。從黑曲霉的老菌絲體中分離的線粒體可以看到，在檸檬酸大量形成時(shí)，TCA循環(huán)中其呼吸作用略有減弱。因此可以證明，在檸檬酸形成的主要階段，存在著烏頭酸酶、需NAD和NADP的異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、富馬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶，并對(duì)-氧-戊二酸脫氫酶有抑制作用。在檸檬酸形成的主要階段，丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、-酮戊二酸、順烏頭酸及異檸檬酸在細(xì)胞中的濃度有什么顯著改變，只有檸檬酸本身的濃度有所改變。有關(guān)由糖形成檸檬酸調(diào)節(jié)方面的研究并不透徹。在由黑曲霉形成的高活性糖酵解系統(tǒng)中，當(dāng)糖的濃度很高，pH為2-4時(shí)，不存在負(fù)能量負(fù)荷的控制。另外由于存在著一條丙酮酸-羧酸

9、酶支路，強(qiáng)烈的分解作用造成檸檬酸的大量積累。細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)只利用了少量積累的檸檬酸。檸檬酸的外流就阻止了自身中毒的發(fā)生。在生產(chǎn)中采用的突變株一般具有烏頭酸水化酶和異檸檬酸脫氫酶活性低的特性。酶的調(diào)節(jié)：檸檬酸是微生物好氣代謝過程的中間產(chǎn)物，正常情況下在胞內(nèi)不會(huì)積累，況且檸檬酸還可作為黑曲霉的碳源，因此，檸檬酸積累是代謝失調(diào)的結(jié)果。從理論上推斷，積累檸檬酸必須使生成檸檬酸的有關(guān)酶系要強(qiáng)大，而檸檬酸后代謝的酶系要微弱，其中糖酵解的調(diào)節(jié)是檸檬酸發(fā)酵最為重要的調(diào)節(jié)。在20世紀(jì)60年代前后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，菌體累積檸檬酸時(shí)，與合成檸檬酸有關(guān)的酶活是增高的。宇佐美等發(fā)現(xiàn)在整個(gè)檸檬酸發(fā)酵周期中，酵解酶系和檸檬酸合成酶始終

10、保持較高的活力。Joshi發(fā)現(xiàn)，黑曲霉進(jìn)入產(chǎn)酸期，合成乙酰CoA和合成草酸乙酰的酶活力增強(qiáng)，這就為檸檬酸的合成提供更多的底物。杜宇檸檬酸累積機(jī)制有關(guān)酶的調(diào)節(jié)控制研究中，主要集中在磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和順烏頭酸水合酶的調(diào)節(jié)上。1. 磷酸果糖激酶（PFK）活性調(diào)節(jié)在黑曲霉的EMP途徑中，PFK是個(gè)調(diào)節(jié)酶，是檸檬酸合成中的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)。在正常生理?xiàng)l件下，該酶被檸檬酸和ATP抑制，而被無機(jī)磷、AMP和銨離子激活，銨離子的存在可有效地解除PFK對(duì)胞內(nèi)檸檬酸積累的敏感性。為了使PFK不受檸檬酸的抑制，則必須變更營養(yǎng)成分的限制與氧的供給。2. 檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)檸檬酸合成酶是TCA環(huán)的起

11、始酶，只對(duì)CoA和ATP的調(diào)節(jié)敏感，ATP-Mg螯合物只起微弱的抑制作用，而其它調(diào)節(jié)物則無影響，因細(xì)胞內(nèi)ATP是以Mg螯合物形式出現(xiàn)，所以ATP對(duì)他影響不太重要，該酶對(duì)乙酰CoA的親和力取決于草酰乙酸的濃度，在檸檬酸積累條件下會(huì)使該酶對(duì)乙酰CoA親和力增強(qiáng)。3. 烏頭酸水合酶的調(diào)節(jié)烏頭酸水合酶催化檸檬酸的分解，此酶合成受阻或失活，導(dǎo)致TCA環(huán)阻斷是檸檬酸積累的關(guān)鍵原因之一。4. 異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)在正常細(xì)胞內(nèi)，檸檬酸可活化異檸檬酸脫氫酶，因而細(xì)胞內(nèi)檸檬酸濃度增加時(shí)便加速異檸檬酸的分解，從而使胞內(nèi)檸檬酸濃度保持穩(wěn)定。檸檬酸對(duì)異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)是黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的基礎(chǔ)。異檸檬酸脫氫酶還受AMP

12、活化而受ATP的抑制，產(chǎn)酸期內(nèi)AMP濃度降低而引起異檸檬酸脫氫酶的抑制，使TCA循環(huán)微弱。發(fā)酵工藝：檸檬酸發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)工藝的發(fā)展可分為3個(gè)階段。20世紀(jì)20年代的由青霉和曲霉的表面發(fā)酵生產(chǎn)為第一階段；30年代開始的曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)為第二階段；從50年代至今以曲霉深層發(fā)酵為主，并進(jìn)行著表面和固體發(fā)酵工藝為第三階段。但其中還有著含糖基質(zhì)發(fā)酵與烷烴類基質(zhì)發(fā)酵之分。（1） 表面發(fā)酵表面發(fā)酵是利用生長在液體培養(yǎng)基表面的微生物之代謝作用，將原料轉(zhuǎn)化為檸檬酸的發(fā)酵方式。這種檸檬酸生產(chǎn)工藝發(fā)明最早，1923年首先由美國Pfizer公司實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，至今仍在沿用，主要采用糖蜜原料發(fā)酵。具體過程如下：首先將糖蜜中

13、的有害物質(zhì)除去，再加入必要的營養(yǎng)鹽并蒸煮滅菌；調(diào)pH至2.2或稍低一點(diǎn)，將該滅菌的培養(yǎng)基放入高度為10-25cm的平盤中，置于事先經(jīng)一定消毒的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28-30，真菌在平面前板上很快形成彼此連接的菌絲體蓋。發(fā)酵過程中，想培養(yǎng)時(shí)吹入相對(duì)濕度為45%-60%的無菌空氣。2-4d后，檸檬酸快速形成，7-10d發(fā)酵結(jié)束。表面培養(yǎng)法產(chǎn)酸率一般為10%-20%，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為70%-95%。將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液抽出，加CaCO3形成檸檬酸鈣沉淀下來。采用表面發(fā)酵，每平方米淺盤每天大約可生產(chǎn)1kg含一個(gè)水分子的檸檬酸。（2） 固體發(fā)酵固體發(fā)酵是將發(fā)酵原料及菌體吸附在疏松的固體支持物上，經(jīng)過微

14、生物的代謝活動(dòng)，將原料中可發(fā)酵成分轉(zhuǎn)化為檸檬酸的發(fā)酵方式。1953年Cahn首先發(fā)明了這種方法，但由于其勞動(dòng)強(qiáng)度太大，未引起重視。1953年日本率先實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，我國的以薯干渣為原料的固體發(fā)酵工藝是于1977年成功投產(chǎn)的。固體發(fā)酵又有薄層發(fā)酵法和厚層通風(fēng)發(fā)酵法之分。其發(fā)酵控制規(guī)程如下： 薄層發(fā)酵法固體發(fā)酵過程，對(duì)溫度和濕度的控制非常重要。曲醅如室的品溫在30-35，在胞子發(fā)芽和菌絲開始發(fā)育時(shí)代謝熱很少，品溫逐漸下降，在此前18h內(nèi)，品溫應(yīng)維持在27-31，18-48h內(nèi)由于代謝熱大量釋放，品溫可維持在38-43。但不得更高，48h后品溫很快將至35左右，直至發(fā)酵結(jié)束。上述適宜的品溫主要通過室溫加

15、以控制，一般室溫控制在26-30，而任其品溫自然變化，但一般不能超過40。另外，上下去盤具有溫差所以在發(fā)酵40h左右要把上下曲盤對(duì)調(diào)一下。為減小這種溫差，上盤曲層的厚度可以小于下層，整個(gè)發(fā)酵期內(nèi)不必翻曲。一般曲房濕度在85%-90%即可。低溫季節(jié)直接通蒸汽，高溫季節(jié)在地上灑水即能起到保濕作用。 厚層通風(fēng)發(fā)酵發(fā)固體厚層發(fā)酵是在薄層發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它的特點(diǎn)是必須由容器的假底向上通風(fēng)，以供給氧氣和帶走熱量，機(jī)械化程度可以提高。這種工藝目前仍在日本占主要地位，但日本主要在設(shè)備方面做了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵密閉化，操作機(jī)械化，和部分自動(dòng)化。厚層發(fā)酵法要求曲層更加疏松，否則厚層的壓實(shí)作用會(huì)造成部分或全部

16、底層物料板結(jié)，難以通風(fēng)。鑒于此，厚層醅中的水分控制非常重要。厚層發(fā)酵的重要控制仍是溫度和濕度。溫度控制程序與薄層發(fā)酵相似。濕度主要靠通風(fēng)量和進(jìn)風(fēng)濕度加以控制，但在某些設(shè)備中可以由水冷裝置協(xié)助控制。厚層進(jìn)風(fēng)的相對(duì)濕度都控制在接近100%，以盡量防止水分蒸發(fā)，因?yàn)楹駥优囵B(yǎng)基中的水分本來就少。曲層厚度在20cm以下時(shí)無需翻料，否則一般都配有翻料裝置。主要優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備占地面積較小，污染雜菌的可能性較小，機(jī)械化程度高，能夠形成較大規(guī)模的生產(chǎn)規(guī)模。 深層發(fā)酵深層發(fā)酵是菌體在液體培養(yǎng)基中，在通氣的條件下通過代謝轉(zhuǎn)化可發(fā)酵原料形成檸檬酸的發(fā)酵方式。該工藝是美國公司Miles首先成功工業(yè)化的，并被當(dāng)今普遍應(yīng)用。我

17、國薯干深層發(fā)酵工藝相當(dāng)簡單，糖化液直接由連消器的維持罐輸入發(fā)酵罐或種子罐中，營養(yǎng)鹽用硫銨，種子培養(yǎng)基接種黑曲霉麩曲，在35左右通風(fēng)培養(yǎng)20-30h，接入發(fā)酵罐。35通風(fēng)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)4d。當(dāng)產(chǎn)酸不再上升，殘?zhí)墙抵?.2%以下時(shí)，發(fā)酵終止，立即進(jìn)入提取。酵母菌利用正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸具有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值，在以烷烴為碳源的培養(yǎng)基中接種這些解脂假絲酵母，在26好氧培養(yǎng)7d，發(fā)酵pH5-6，對(duì)烴轉(zhuǎn)化率為100%-130%。酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的缺點(diǎn)在于其發(fā)酵過程中會(huì)有較高的副產(chǎn)物異檸檬酸積累，但人們可以通過育種手段選育積累異檸檬酸能力弱的突變株予以解決。提取工藝：我國檸檬酸提取目前普遍采用鈣鹽法工藝：發(fā)酵液

18、經(jīng)加熱處理后，過濾，濾液中加入CaCO3或石灰乳中和，形成檸檬酸鈣沉淀。再加入H2SO4酸解，使檸檬酸游離出來，硫酸根則以硫酸鈣形式被濾除。獲得粗檸檬酸液通過脫色和離交凈化，除去色素和膠體雜質(zhì)以及無機(jī)離子。凈化后的檸檬酸經(jīng)濃縮后形成結(jié)晶，離心分離晶體，母液則重新凈化后濃縮、結(jié)晶。晶體經(jīng)干燥和檢驗(yàn)后出廠。除了鈣鹽法工藝，我國還在研究其他提取工藝，主要有色譜分離技術(shù)、吸附交換法提取技術(shù)和熱水洗脫色譜分離技術(shù)。色譜分離技術(shù)由中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境中心研究成功的ILCS工藝，已在阜陽檸檬酸廠進(jìn)行了年產(chǎn)2000噸工業(yè)化試驗(yàn)。特點(diǎn)是：采用對(duì)檸檬酸分子具有高效分離特性的離子交換樹脂，從檸檬酸發(fā)酵液中分離檸檬酸。強(qiáng)化了發(fā)酵過濾液的預(yù)處理，除去非檸檬酸雜質(zhì)，使成品檸檬酸中易碳化物含量達(dá)標(biāo)。提取液中檸檬酸濃度高達(dá)20%-40%，可減少其濃縮能耗，其分離液可用鹽酸、磷酸、硝酸、硫酸，NaOH、KOH、NH4OH等無機(jī)酸或無機(jī)堿水溶液，因此分離廢水可通過蒸發(fā)結(jié)晶工序制成化肥，生產(chǎn)1t檸檬酸產(chǎn)0.7t硫酸鈉，降低了成本?？偸章士蛇_(dá)85%-90%，唯因連續(xù)串聯(lián)運(yùn)行進(jìn)料壓力較高，樹脂破損率較大。吸附交換法提取技術(shù)由天津科技大學(xué)研究成功，已在黑龍江甘南檸檬酸廠進(jìn)行5000t規(guī)模的工業(yè)化試驗(yàn)。特點(diǎn)：采用吸附交換量大、抗污染活性強(qiáng)、不易破碎的離子交換樹脂，從檸檬酸發(fā)酵液中高效率的分離