(完整版)PCR技術(shù)的原理與方法

1、pcrpcr技術(shù)的原理與方法技術(shù)的原理與方法 鐘召迪鐘召迪pcr定義l 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction)簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。l 是指在dna 聚合酶的催化下，以母鏈dna 為模板，一特定引物為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出于母鏈模板dna互補(bǔ)的子鏈dna的過程。l 可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等。pcr反應(yīng)特點(diǎn)l特異性強(qiáng)l靈敏度高l簡(jiǎn)便、快速l對(duì)標(biāo)本的純度要求低pcr技術(shù)的基本原理lpcr的反應(yīng)成分lpcr的反應(yīng)基本步驟lpcr的反應(yīng)體系pcr的反應(yīng)成分l模板dna l引物l

2、四種脫氧核糖核苷酸ldna聚合酶l反應(yīng)緩沖液，mg2pcr的反應(yīng)基本步驟lpcr的反應(yīng)基本步驟l變性：高溫使雙鏈dna解離成單鏈（94 ，30s）l退火：低溫下，引物與dna模板互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55 ， 30s ）l延伸：中溫延伸，dna聚合酶催化以引物為起點(diǎn)的dna鏈延伸反應(yīng)（7072 ，3060s）pcr的反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液 1/10體積 4種dntp混合物 各200umol/l 引物 (2個(gè)) 0.2umol/l 模板dna 102 105 taq dna聚合酶 1 2.5單位/反應(yīng)體系 mg2+ 1.52.5mmol/l 加雙或三蒸水至 25 50ulpcr反應(yīng)五要素l引物（prim

3、er）l 酶 （taq dna polymerase） l dntp （datp,dgtp,dctp,dttp） l模板 （template） lmg2+ （magnesium）引物l引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵lpcr 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板dna互補(bǔ)的程度l理論上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 pcr就可將模板dna在體外大量擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)的原則l引物最好在模板cdna的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)l引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間l引物gc含量在40%60%之間，tm值最好接近72l引物3端要避開密碼子的第3位l引物3端不能選擇a，最好選擇tl堿基要隨機(jī)分布l

4、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列引物設(shè)計(jì)的原則l引物5 端和中間g值應(yīng)該相對(duì)較高，而3 端g值較低l引物的5端可以修飾，而3端不可修飾l擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)l引物應(yīng)具有特異性酶及其濃度l目前有兩種 taq dna 聚合酶供應(yīng) 天然酶：從棲熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成l一個(gè)典型的 pcr反應(yīng)約需酶量 2.5u（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)）l濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少dntp 的質(zhì)量與濃度dntp的質(zhì)量與濃度和 pcr擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dntp呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性失活dntp溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1m naoh或1m tris

5、-hcl的緩沖液將其ph調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dntp降解在pcr反應(yīng)中，dntp應(yīng)為50200umol/l，尤其是注意4種dntp的濃度要相等（等摩爾配制 ）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低pcr產(chǎn)物的產(chǎn)量dntp 能與mg2+結(jié)合，使游離的mg2+濃度降低模板（靶基因，target gene）l模板核酸的量與純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一l傳統(tǒng)的dna純化方法通常采用sds和蛋白酶k 來消化處理標(biāo)本sds 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋

6、白，sds 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶k 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與dna結(jié)合的組蛋白, 再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸mg2+濃度lmg2+對(duì)pcr擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響l在一般的 pcr反應(yīng)中，各種ntp濃度為200umol/l時(shí)，mg2+濃度為1.52.0 mmol/l為宜lmg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過低會(huì)降低 taq dna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少pcr反應(yīng)條件的選擇 pcr反應(yīng)條件: : 溫度 時(shí)間 循環(huán)次數(shù)溫度與時(shí)間的設(shè)置l設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)l標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈dna在909

7、5變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸l對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸變性溫度與時(shí)間l變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致pcr失敗的最主要原因l一般9394lmin足以使模板dna變性 若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間 但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。l此步若不能使靶基因模板或pcr產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致pcr失敗退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間l退火溫度是影響pcr特異性的較重要因素l變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板dna 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞l退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度l對(duì)于20個(gè)核苷酸，g+c含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想延伸溫度與時(shí)間l延伸溫度：一般選擇在7075之間 常用溫度為72 過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。l延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定 1kb以內(nèi)的dna片段，延伸時(shí)間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min 擴(kuò)增10kb需延伸至15minl延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性