第二十篇 藥物的體外抗菌試驗(yàn)

1、第二十章 藥物的體外抗菌試驗(yàn) 藥物的體外抗菌試驗(yàn)（antimicrobial test in vitro） 是在體外測定微生物對藥物敏感程度的實(shí)驗(yàn)，已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。 如：抗菌藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的測定、藥物含量的測定、藥物濃度的測定、指導(dǎo)臨床用藥的藥敏實(shí)驗(yàn)等。 抗菌實(shí)驗(yàn)包括抑菌實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)。抑菌實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)。抑菌：即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微生物，在藥物除去后微生物又能生長；殺菌：即能殺死微生物，當(dāng)藥物除去后，微生物也不能再生長繁殖。兩者并非絕對，只是在一定條件下相對而言。 第一節(jié) 常用的體外抑菌實(shí)驗(yàn) 體外抑菌實(shí)驗(yàn)是最常用的抗菌實(shí)驗(yàn)，方法簡便，需時(shí)短

2、，用藥量少，不需要?jiǎng)游锖吞厥庠O(shè)備，一般在玻璃器皿中進(jìn)行。 常用的方法有連續(xù)稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。連續(xù)稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。 一、連續(xù)稀釋法（serial dilution test） 可用于測定藥物的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。1、液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 在一系列試管中，將液體培養(yǎng)基按一定的倍數(shù)稀釋藥物，獲得藥物濃度遞減的系列試管，然后在每一管中加入定量實(shí)驗(yàn)菌，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，肉眼觀察試管混濁情況，記錄抑制實(shí)驗(yàn)菌生長的最低濃度（即MIC）。 圖 20-1液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2、固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 分平板法和斜面法。 1） 平板法可同時(shí)測定

3、大批實(shí)驗(yàn)菌株的MIC，且不受藥物顏色及混濁度的影響，適于中藥中藥制劑或評價(jià)新藥的藥效學(xué)（藥物的體外抗菌制劑或評價(jià)新藥的藥效學(xué)（藥物的體外抗菌活性測定活性測定）實(shí)驗(yàn)。 將系列濃度的藥物混入瓊脂培養(yǎng)基，使制成一批藥物濃度呈系列遞減的平板。然后將含有一定細(xì)胞數(shù)的實(shí)驗(yàn)菌液（通常為為104左右左右）以點(diǎn)接種法接種于平板上，可以逐個(gè)點(diǎn)種，也可采用多點(diǎn)接種器接種；同時(shí)設(shè)無藥空白平板對照。培養(yǎng)后觀察結(jié)果。 2）斜面法 是固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋法的一種，是將系列濃度的各藥分別混入固體培養(yǎng)基中制成斜面，在斜面上接種一定量的實(shí)驗(yàn)菌，然后觀察是否有菌生長，判斷MIC值。 二、瓊脂擴(kuò)散法（agar diffusion t

4、est ） 是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評價(jià)藥物抗菌作用強(qiáng)弱的原理設(shè)計(jì)而成，具有各種不同的方法。 常用的有以下幾種： 1、濾紙片法 瓊脂擴(kuò)散法中最常用方法 適用于新藥的初篩實(shí)驗(yàn)（初步判斷藥物是否與抗藥作用）及臨床的藥敏實(shí)驗(yàn)（細(xì)菌對藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，以便選擇用藥），可進(jìn)行多種藥物或一種藥物不同濃度對同一種實(shí)驗(yàn)菌的抗菌實(shí)驗(yàn)。 首先將實(shí)驗(yàn)菌均勻混入瓊脂培養(yǎng)基，制成含菌平板，然后將一定大小的濾紙片蘸取藥液置于平板上，培養(yǎng)后即可觀察結(jié)果。根據(jù)抑菌圈直徑的大小，評價(jià)藥物抗菌作用的強(qiáng)弱。WHO于1981年曾推薦Kirby-Bau

5、er 法（k-B法）作為標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏實(shí)驗(yàn)。 k-B法基本原理是濾紙片法，但需用統(tǒng)一的培養(yǎng)基、菌液濃度、紙片質(zhì)量、紙片含藥量以及其他實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果判斷以卡尺精確量取，根據(jù)抑菌圈的直徑大小判斷該菌對藥物是抗藥、中等敏感或敏感。 2、打孔法2、打孔法 在含瓊脂平板上打孔，孔內(nèi)加入藥液，經(jīng)培養(yǎng)后可產(chǎn)生一定大小的抑菌圈。適于藥物血濃度的監(jiān)測，血清用量少，敏感性高，操作簡便。3、挖溝法 先制備瓊脂平板，在平板上挖溝，溝的兩邊垂直劃線接種各種實(shí)驗(yàn)菌，再在溝內(nèi)加入藥液。培養(yǎng)后根據(jù)溝兩邊所生長的實(shí)驗(yàn)菌離溝的抑菌距離來判斷對這些菌的抗菌效力。適用于在一個(gè)平板上實(shí)驗(yàn)一種藥物對幾種實(shí)驗(yàn)菌的抗菌作用。H:其他-中藥婦炎

6、樂藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第二節(jié) 殺菌試驗(yàn) 一、最低殺菌濃度或最低致死濃度的測定 殺菌實(shí)驗(yàn)用以評價(jià)藥物對微生物的致死活性。 最低殺菌濃度最低殺菌濃度指該藥物能殺死細(xì)菌的最低濃度。 從對微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度最低致死濃度（MLC）。一般是將待檢藥物先以合適的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進(jìn)行連續(xù)稀釋，每管內(nèi)再加入一定量的試驗(yàn)菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點(diǎn)以上未長菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無菌平板上圖20-1，培養(yǎng)后凡平板上無菌生長的藥物最低濃度即為該藥物的MBC（或MLC） MBC（或MLC）的含義也可定義為在一定條件下，使絕大多數(shù)微生物被殺死，但允許有最少量微生物存活的藥物最低濃度

7、。 據(jù)此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，在藥物連續(xù)稀釋后，每管內(nèi)加入定量實(shí)驗(yàn)活菌液（105-106細(xì)菌/ml）。培養(yǎng)后從肉眼觀察無菌生長的試管內(nèi)各取培養(yǎng)液0.1ml或0.01ml涂布于平板上測定存活菌數(shù)，以使99.9%微生物致死的藥物最低濃度為MLC，即在一定條件下，存活的菌數(shù)不多于原始接種數(shù)的0.1%. 二、活菌計(jì)數(shù)法（viable counting method） 是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的實(shí)驗(yàn)菌，作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從存活的微生物數(shù)計(jì)算出藥物對微生物的致死率。 活菌計(jì)數(shù)的方法：活菌計(jì)數(shù)的方法：一般是取實(shí)驗(yàn)菌與藥物作用后的混合液，經(jīng)稀釋后取定量混入瓊脂培養(yǎng)基，傾注成平板。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)長出的

8、菌落數(shù)或菌落形成單位（CFU）。再乘以稀釋倍數(shù)，即可得藥物稀釋后每毫升內(nèi)存活的細(xì)菌數(shù)或CFU。如果藥物作用后，存活菌數(shù)很少，也可采用微孔濾膜過濾法測定。 三、石炭酸系數(shù)測定法（phenol coefficient） 又稱酚系數(shù)法，是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，作用一定時(shí)間，將待測的化學(xué)消毒劑與石炭酸對傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較，所得殺菌效力的比值。石炭酸系數(shù)是了解消毒劑殺菌效力的一種方法。 石炭酸系數(shù)石炭酸系數(shù) =消毒劑的殺菌稀釋度/石炭酸的殺菌稀釋度 石炭酸系數(shù) 大于或等于2為合格。 舉例：將石炭酸準(zhǔn)確稀釋為1：90、1：100，、等；待測消毒劑準(zhǔn)確稀釋1：150、1

9、：170、。 分別取上述稀釋液各5ml（10ml）加入一系列無菌試管中，置于20恒溫水浴，使反應(yīng)保持在20以下進(jìn)行。各管內(nèi)再加入傷寒沙門菌培養(yǎng)液各0.5ml,立即開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí),在加菌后5、10、15分鐘，分別從管中取一接種環(huán)的混合液接種于一支5ml（或10ml）的肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察并記錄結(jié)果。+為有菌生長，-為無菌生長。 表20-1石炭酸系數(shù)測定 濃度 作用時(shí)間 5 10 15石炭酸 1:90 - - - 1:0 + - - 1:10 + + -消毒劑 1:150 - - - 1:170 - - - 1:200 - - - 1:225 - - - 1:250 + - - 1:2

10、75 + + - 根據(jù)5分鐘不能殺菌，10分鐘能殺菌的最大稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算，則石炭酸系數(shù)=250/100=2.5 或根據(jù)三個(gè)相同殺菌結(jié)果的稀釋度比值的平均值來計(jì)算,則: 石炭酸系數(shù) =(225/90+250/100+275/110)/3=2.5 石炭酸系數(shù)愈大,則被測消毒劑的效力愈高.但石炭酸系數(shù)的應(yīng)用有一定局限性,因?yàn)槟骋幌緞抽T菌的石炭酸系數(shù)的大小并不能完全代表它對其他細(xì)菌作用的強(qiáng)弱.另外,石炭酸系數(shù)法還有以下缺點(diǎn):1)有機(jī)物存在時(shí)消毒劑失去活性;2)消毒劑可能對組織有毒性;3)隨溫度變化而影響測定結(jié)果;4)只適用于同類消毒劑的殺菌效力測定,對非酚類、季銨鹽及不穩(wěn)定的次氯酸鹽等均

11、不能給予正確評價(jià). 第三節(jié) 聯(lián)合抗菌試驗(yàn) 在藥學(xué)中，常需要檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互作用以及抗菌藥物與不同PH值或不同離子溶液的相互影響。 加強(qiáng)藥物抗菌作用的為協(xié)同（synergism）； 減弱藥物作用的為拮抗（antagonism）； 互相無影響的為無關(guān)（indifference）； 作用二者之和為累加（addition）。 聯(lián)合抗菌試驗(yàn)的常用方法 一、紙條試驗(yàn)（paper strip test） 即在已接種實(shí)驗(yàn)菌的平板表面垂直放置兩條浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或無影響來判斷它們在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。 圖20-2是紙條實(shí)驗(yàn)的示意圖。 圖20-2是紙條實(shí)驗(yàn)的示意圖

12、。圖中A列的兩紙條中只有一條含有抗菌藥物，另一條不含抗菌藥物；B列的兩紙條均含有抗菌藥物。 二、梯度平板紙條試驗(yàn) （paper strip-gradient plate test） 需先制備含藥的梯度平板。梯度平板的制備是先將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜置待凝，再將平板放置水平，加入含抗菌藥物的瓊脂培養(yǎng)基。在重疊的雙層平板中含有梯度濃度的抗菌藥物，自高濃度（+）至低濃度（-）依次遞減。要求其抑菌濃度的位置約處于平板的一半。將實(shí)驗(yàn)菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如待檢藥液對平板的藥物有加強(qiáng)作用，則可見紙條兩端的抑菌區(qū)被擴(kuò)大。 圖

13、20-3 紙條梯度平板試驗(yàn) 三、棋盤格法（check board test） 是由于在試驗(yàn)時(shí),含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名,用以評價(jià)兩種藥物同時(shí)用不同濃度進(jìn)行聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)排列6排試管，每排6管，共36管使成方塊，A及B藥各以液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，A藥各稀釋度縱行定量加入各管，B藥各稀釋定量按橫排加入，兩藥同時(shí)作單獨(dú)抗菌實(shí)驗(yàn)對照。然后加入定量菌液，經(jīng)培養(yǎng)后觀察結(jié)果。棋盤格法的結(jié)果用部分抑菌濃度（FIC）及FIC指數(shù)來評價(jià)。 FIC：又稱聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)，指某一藥在聯(lián)合前后所測得的MIC比值。如二待測藥為A、B，則 FIC（A）=A 藥與 B藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)A藥的 MIC A

14、藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MIC FIC（B）=B藥與 A藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)B藥的 MIC B藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MIC 所謂FIC指數(shù)，指二藥各自的FIC之和，即 FIC指數(shù)= FIC（A）+ FIC（B） FIC指數(shù)小于1，兩藥有協(xié)同作用，即兩藥聯(lián)合較單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的抑菌作用為強(qiáng)。 FIC指數(shù)的值愈小，則聯(lián)合抗菌作用愈強(qiáng)。如20-2 如20-2 FIC指數(shù)與聯(lián)合抗菌效應(yīng) FIC指數(shù) 聯(lián)合抗菌效應(yīng) 小于0.75 協(xié)同 1 累加 1-2 無關(guān) 大于2 拮抗 第四節(jié) 體外抗菌試驗(yàn)的影響因素 1、試驗(yàn)菌 一般應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株來自專門的供應(yīng)機(jī)構(gòu)。我國由北京衛(wèi)生部生物制品檢定所菌種保藏中心供應(yīng)。在特定條件下，有時(shí)需用臨床新分離菌株。試驗(yàn)菌加以合理的保藏，使用前應(yīng)加以純化及必要的生物學(xué)特征鑒定。 2、培養(yǎng)基 原料、成品的外觀及性能應(yīng)符合要求。3、抗菌藥物 藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，需要精確配制 。固體藥物應(yīng)配制成溶液使用，有些不溶于水的藥