045細(xì)胞融合2

1、 第第5章章細(xì)胞融合細(xì)胞融合一、一、 定義定義n細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過物理、生物或化學(xué)方法融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。n細(xì)胞融合（cell fusion）又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridization），是指將不同來源的原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術(shù)。n可以避開生殖細(xì)胞的受精過程，在親緣更遠(yuǎn)的物種間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。細(xì)胞融合的意義細(xì)胞融合的意義白菜白菜甘藍(lán)甘藍(lán)白菜白菜 甘藍(lán)甘藍(lán)細(xì)胞融合請(qǐng)同學(xué)們討論

2、如何實(shí)現(xiàn)請(qǐng)同學(xué)們討論如何實(shí)現(xiàn)? ?對(duì)稱融合對(duì)稱融合非對(duì)稱融合非對(duì)稱融合n原理：將兩個(gè)來源不同的原生質(zhì)體或細(xì)胞通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)其細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞,繼而再以適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行雜種細(xì)胞分檢和培養(yǎng),促使細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、直至形成雜種植株，從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源物種間的轉(zhuǎn)移隨機(jī)結(jié)合、融合二、基本原理二、基本原理細(xì)胞融合過程主要經(jīng)過包括：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞相互靠近、細(xì)胞橋形成、細(xì)胞質(zhì)滲透和細(xì)胞核融合。(1)(1)(2)(3)(4)(5)顯微鏡下的細(xì)胞融合過程 甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場(chǎng)下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融

3、合完成。融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化過程 n類脂質(zhì)分子發(fā)生擾動(dòng)和重排n導(dǎo)致細(xì)胞橋的形成n細(xì)胞質(zhì)、核相互融合三、三、 發(fā)展歷史發(fā)展歷史n細(xì)胞融合現(xiàn)象最初是在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。1858年菲爾紹夫發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。天花病人血液中也有多核體細(xì)胞存在。n1875年lange第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生的合并現(xiàn)象。n1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(hvj)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。n1965年英國(guó)海利斯等進(jìn)一步證實(shí)滅活的病毒在適當(dāng)?shù)臈l件下可以誘發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合，不同的動(dòng)物細(xì)胞可以被誘導(dǎo)融合，并可以存活。n20世紀(jì)七十年代初，華裔加籍科

4、學(xué)家高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(peg) 能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。n19721972年卡爾森等通過兩個(gè)煙草品種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體年卡爾森等通過兩個(gè)煙草品種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種。細(xì)胞雜種。n19781978年梅爾徹斯年梅爾徹斯(melchers)(melchers)等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細(xì)胞雜等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細(xì)胞雜種種“potamato“potamato”。n 目前，已得到栽培煙草與野生煙草、栽培大豆與野生大豆、秈稻與野生目前，已得到栽培煙草與野生煙草、栽培大豆與野生大豆、秈稻與野生稻、秈稻與粳稻、小麥與鵝冠草等細(xì)

5、胞雜種及其后代，獲得了有價(jià)值的稻、秈稻與粳稻、小麥與鵝冠草等細(xì)胞雜種及其后代，獲得了有價(jià)值的n新品系或育種上有用的新材料。新品系或育種上有用的新材料。 n細(xì)胞融合技術(shù)逐步擴(kuò)展到植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。伴隨者細(xì)胞融合技術(shù)的成熟，20世紀(jì)80年代，真正意義上的細(xì)胞工程誕生了。細(xì)胞融合現(xiàn)已成為細(xì)胞工程的核心技術(shù)之一。 四四 細(xì)胞融合的關(guān)鍵技術(shù)細(xì)胞融合的關(guān)鍵技術(shù) n（一）融合材料的獲得（一）融合材料的獲得n問題一：怎樣獲得植物細(xì)胞與動(dòng)物的單問題一：怎樣獲得植物細(xì)胞與動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞？個(gè)細(xì)胞？ （二）細(xì)胞融合的方法（二）細(xì)胞融合的方法 物理法、化學(xué)法及生物法物理法、化學(xué)法及生物法物理法主要包括顯微操作、電場(chǎng)

6、刺激(電融合法)等；化學(xué)法主要是用peg誘導(dǎo)，高ca2+和ph誘導(dǎo)，高ca2+和ph結(jié)合peg誘導(dǎo)，鹽類離子（nano3 、cano3、cacl2）生物法有仙臺(tái)病毒(hvj)法等。仙臺(tái)病毒(hvj)法、 peg法、電融合法適用于動(dòng)物誘導(dǎo)細(xì)胞融合。peg法、電融合法適用于植物細(xì)胞融合。微生物只適合用peg法。1、物理法-電融合誘導(dǎo)法電融合誘導(dǎo)法(1)(1) 基本原理n在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，產(chǎn)生電勢(shì)，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉合成完整的膜融合體。(2)特點(diǎn)：n融合率高、重復(fù)性與可控

7、制性強(qiáng)。n裝置精巧、方便簡(jiǎn)單。n可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程。n可能會(huì)造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。 (3)(3)電融合裝置電融合裝置(4)(4)電融合誘導(dǎo)法基本過程電融合誘導(dǎo)法基本過程電融合裝置的電極有兩種：微電極型和平行多電極型： （l）將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室中，微電極型只有一個(gè)小室，平行電極型有4個(gè)小室，兩電極間隔3mm，整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中。 （2）微電極型的兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩個(gè)靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，微電極所產(chǎn)生的512ma的脈沖電流間斷刺激l5ms，原生質(zhì)體在累計(jì)幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連

8、接到面連接，最后形成融合體，整個(gè)過程大約1030min。 （3）平行多電極通過1兆赫（mhz）交流電場(chǎng)發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度（如 50ma 12 2kvcm）的直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體。2、生物法n各種病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，它一邊粘接在一個(gè)細(xì)胞表面，另外一邊粘接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。 (1) 特點(diǎn)n研究最早的促融劑。n毒性大而使應(yīng)用受到限制。n仙臺(tái)病毒（haj）是兩層磷脂組成的外膜包裹著rna與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因haj病毒毒力弱，易被滅活而常采用。(2)

9、 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟a 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近。b 通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透。c 兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，融為一體。d 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。(3) 原理與過程n滅活后的病毒顆粒結(jié)合到原生質(zhì)體表面。兩受體細(xì)胞開始凝聚。n兩細(xì)胞的膜緊密結(jié)合。病毒被膜與受體細(xì)胞的漿膜融合。病毒顆粒周圍的膜脫離整個(gè)膜，產(chǎn)生破口，在兩細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)通道（37度下1-2分鐘），通道繼續(xù)擴(kuò)大，病毒顆粒流入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)互相融合。n融合細(xì)胞變圓，融合結(jié)束。滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表

10、面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）3、化學(xué)法n包括peg誘導(dǎo)，高ca2+和ph誘導(dǎo)，高ca2+和高ph值結(jié)合peg誘導(dǎo)，nano3等。鹽離子誘導(dǎo)：聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)是一種多聚化合物，分子式為h(ohch2-ch2)noh),商品名叫卡波臘。peg誘導(dǎo)：peg與溶液中自由水結(jié)合，高度脫水后引起原生質(zhì)體凝聚、扭曲變形、細(xì)胞膜連接處發(fā)生融合，形成很小的細(xì)胞橋，之后擴(kuò)大，最終徹底融合。peg誘導(dǎo)：高ca2+和ph誘導(dǎo)peg結(jié)合誘導(dǎo)n高ca2+機(jī)

11、制：帶負(fù)電荷間的原生質(zhì)體在鈣離子的連接下形成靜電鍵鈣橋，促使異源的原生質(zhì)體間粘著和結(jié)合。n高ph：增加ca2+在細(xì)胞表面的黏附，從而促進(jìn)兩原生質(zhì)體的接觸。( (三三) ) 影響細(xì)胞融合的主要因素影響細(xì)胞融合的主要因素n1、植物細(xì)胞融合(p170)(1)peg誘導(dǎo)融合的關(guān)鍵是作用時(shí)間。(2)peg規(guī)格和純度與融合效率（4000-6000）。(3)在電融合時(shí)，融合率與原生質(zhì)體密度有關(guān)。(4)在融合液中加入少量cacl2，即可以維持一定量的電導(dǎo)率，對(duì)細(xì)胞也有保護(hù)作用，交變電流強(qiáng)弱、處理時(shí)間長(zhǎng)短及電脈沖大小均會(huì)影響融合效率。(5)用混合鹽溶液對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行酶處理，以及在促融劑中添加伴刀豆球蛋白、二甲基

12、亞砜、胰蛋白酶、精胺或亞精胺等也可提高融合效率。n2、動(dòng)物細(xì)胞融合在動(dòng)物細(xì)胞融合過程中，除融合劑外，其它如細(xì)胞性質(zhì)、溫度、ph、離子強(qiáng)度及離子種類等均會(huì)影響細(xì)胞融合效率。(1)表面性質(zhì)(2)細(xì)胞種類(3)細(xì)胞融合時(shí)適宜的溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。(4)細(xì)胞融合時(shí)，通常耗氧量較大，缺氧時(shí)經(jīng)常不融合。(5)ca2+(6)適宜的ph值(7.2-7.4)1、制備單克隆抗體、制備單克隆抗體2、診斷、治療、預(yù)防疾病。、診斷、治療、預(yù)防疾病。例如：?jiǎn)慰乖\斷盒、例如：?jiǎn)慰乖\斷盒、“生物生物導(dǎo)彈導(dǎo)彈”治療癌癥治療癌癥獲得雜種植株獲得雜種植株1、克服遠(yuǎn)緣雜交不親障礙、克服遠(yuǎn)緣雜交不親障礙2、克服有性雜交的母系遺、克服有性雜

13、交的母系遺傳、獲得細(xì)胞質(zhì)基因的雜合傳、獲得細(xì)胞質(zhì)基因的雜合子、研究細(xì)胞質(zhì)遺傳子、研究細(xì)胞質(zhì)遺傳用途用途物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒物理（離心、振動(dòng)、物理（離心、振動(dòng)、電刺激）電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性原理原理動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目植物、動(dòng)物細(xì)胞融合的比較植物、動(dòng)物細(xì)胞

14、融合的比較(p166)(p166)五、 融合細(xì)胞篩選因融合的隨機(jī)性而成為細(xì)胞融合的關(guān)鍵而必需的技術(shù)1 篩選的原因n細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。n問題：a與b融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的細(xì)胞嗎？na-b，a-a，b-b。na-a-a，b-b-b等多聚體。n未融合的a，b。2細(xì)胞融合后產(chǎn)生的類型n(1)同核型同源原生質(zhì)體的融合體n(2)異核型非同源原生質(zhì)體的融合體n(3)多核體含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體3雜種細(xì)胞篩選方法 (p171)1）遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一

15、個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。n 如親本1：葉綠體缺陷型 親本2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞長(zhǎng)成植株呈綠色，并能成長(zhǎng)n2）抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。n如：n親本1：對(duì)放線菌素d抗性，但在ms培養(yǎng)基上不能超過50個(gè)世代n親本2：對(duì)放線菌素d很敏感，但能在ms上生長(zhǎng)n雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的ms培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而親本和其它細(xì)胞死亡3）利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。 親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體

16、 親本2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分n4）利用生長(zhǎng)特性篩選法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。n例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長(zhǎng)，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。n1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對(duì)藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。n親本a：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡娜霉素不敏感n親本b：對(duì)卡娜霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感n雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)n2）營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可

17、以篩選雜種細(xì)胞。n親本a：色氨酸缺陷型n親本b：蘇氨酸缺陷型n雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。n3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長(zhǎng)。由此篩選雜種細(xì)胞。n親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長(zhǎng)。n親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。n雜種細(xì)胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。六、 細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用1、動(dòng)物細(xì)胞融合-單克隆抗體生產(chǎn)多克隆抗體與單克隆抗體n動(dòng)物脾臟有上百萬個(gè)b淋巴細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。n一

18、種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。n血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對(duì)某一個(gè)抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。n如果我們能分離得到只分泌某一種特異性抗體的b淋巴細(xì)胞，不就可以大量生產(chǎn)相關(guān)單抗了嗎？n問題：可以實(shí)現(xiàn)嗎？有什么技術(shù)限制嗎？（1）歷史發(fā)現(xiàn)n1975年，德國(guó)和英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的科萊爾和米爾斯坦，將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（b淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特

19、征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。培養(yǎng)成細(xì)胞系，獲得高度純合的抗體單克隆抗體。 n1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。（2）雜交瘤技術(shù)n雜交瘤技術(shù)：將瘤細(xì)胞（骨髓瘤）與免疫動(dòng)物的脾或淋巴細(xì)胞融合而制成雜種細(xì)胞。n骨髓瘤-b淋巴細(xì)胞雜交瘤：既具有骨髓瘤細(xì)胞無限的繁殖能力，又具備b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的功能。（3）具體步驟單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖仙臺(tái)病毒或聚乙二醇的誘導(dǎo)下融合 a、動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備 n一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免役（向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體）、加強(qiáng)免疫（向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體）三個(gè)過程。如果需要免疫脾細(xì)

20、胞，一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。 b、骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng) n骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。n一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。c c、細(xì)胞融合、細(xì)胞融合 n（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。 （2）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。 （3）30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分

21、子量的peg，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止peg作用。（4）離心，棄上清，用20小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100l孔，37、5co2孵箱培養(yǎng)。 融合后的細(xì)胞類型n融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體等。n正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅57天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。n剩余：脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞，其中后兩種需進(jìn)行特別的篩選去除。d、 融合細(xì)胞的篩選hat培養(yǎng)基篩選法n培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine

22、，h）、氨基蝶呤（aminopterin，a）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，t），所以取三者的字頭稱為hat培養(yǎng)基。篩選原理ndna的合成： 葉酸輔酶n正常途徑：糖、氨基酸核苷酸dna ，可以被氨基蝶呤(葉酸的拮抗劑)阻斷n 胸腺嘧啶核苷激酶（tk）n補(bǔ)救途徑：核苷酸前體 核苷酸dnan 次黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）n氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成dna，因此hat培養(yǎng)基上的細(xì)胞不能采用該途徑合成dna。n融合所用的瘤細(xì)胞一般是hprt與tk缺陷型，因此也不能采用補(bǔ)救途徑合成dna。n兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？n瘤細(xì)胞（未融合的和多聚體）命運(yùn)：因不能正常合成dna而

23、死亡。n融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的hprt與tk ，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成dna，因此可在hat培養(yǎng)基中存活與繁殖。e、分泌抗體的融合細(xì)胞的檢測(cè) elisa方法檢測(cè)抗體n將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時(shí)間后取上清以elisa法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。n找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。f f、單克隆抗體的大量生產(chǎn)、單克隆抗體的大量生產(chǎn)n(1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。n(2)(2)體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制

24、備腹水與血清。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水與血清。n1）實(shí)體瘤法 n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按13107cellsml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mgml(采血量有限)。 n2）腹水制備法 n腹腔注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。n腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法。(3(3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞

25、大規(guī)模生產(chǎn)單抗n雜交瘤細(xì)胞：wut3雜交瘤細(xì)胞 n生物反應(yīng)器 ：采用3.5升、14升、75升攪拌式生物反應(yīng)器，具有自動(dòng)消毒、控制溫度、轉(zhuǎn)速、do和ph等功能。n培養(yǎng)液 ：rpmi1640中添加慶大霉素至100單位、胎牛血清（ncs）或健康人血清（hus）、添加劑hen（蛋白胨和糖類）。培養(yǎng)方式 n控制溫度在37、ph7.1、轉(zhuǎn)速40-60r/min、do在30%-50%，分批和半連續(xù)培養(yǎng)。n離心機(jī)除去細(xì)胞，收集上清液用于單抗?jié)舛?、免疫活性、熱原等分析測(cè)定。 結(jié)果n3.5升攪拌式生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)，wut3雜交瘤細(xì)胞經(jīng)48小時(shí)適應(yīng)期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，維持24小時(shí)后進(jìn)入平衡期，這一階段持續(xù)約48小時(shí)，分泌單抗。 n繼續(xù)放大至75升生物反應(yīng)器，半連續(xù)生產(chǎn)，細(xì)胞濃度達(dá)到1.5106/ml，單抗產(chǎn)量為50-70g/ml。這樣每間隔2天收獲1批，獲得上清液40升，平均日產(chǎn)單抗達(dá)1克。 2 2、利用原生質(zhì)體融合培養(yǎng)技術(shù)培育新植株、利用原生質(zhì)體融合培養(yǎng)技術(shù)培育新植株n(1) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)意義na 融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種nb 分離或